EMS 诱变技术研究概况及应用进展

谢玲玲，周火强，弭宝彬，倪向江，陈玲欢

（1. 湖南省蔬菜研究所，湖南 长沙 410125；2. 长沙市农产品质量监测中心，湖南 长沙 410003）

EMS（Ethyl Methane Sulfonate，甲基磺酸乙酯）是 一种烷化剂，其诱变机理是通过与核苷酸中的嘌呤、嘧啶分子直接反应来诱发突变。EMS 诱发形成突变体主要通过两个步骤完成：首先鸟嘌呤的C6 位置被烷基化，而后在DNA 复制过程中，烷基化的鸟嘌呤与胸腺嘧啶配对，导致碱基交换，即G：C 变为A：T，形成点突变[1]。采用EMS 作为诱变剂，具有易操作、成本低、专一性强，产生点突变频率高，出现染色体畸变频率低等优势[2]。EMS 作为一种高效、稳定的化学诱变剂，是当前构建大规模饱和突变体库的理想诱变方法[3-5]，目前在诱变育种中应用最为广泛，效果也最好。

早在20 世纪60 年代，人们就已开始采用EMS 水溶液处理植物种子，但诱变效率很低。自Neuffer等将EMS 溶于石蜡油中处理玉米花粉获得成功后，石蜡油-EMS 处理花粉诱变技术在国外广泛应用起 来[6]。我国于80 年代末期开始进行EMS 诱变研究。杜连恩等研究发现，平阳霉素（PYM）后处理能提高甲基磺酸乙醋（EMS）的诱变效果。试验结果证明，EMS 处理小麦湿种子附加PYM 后处理的MZ 代植株诱变频率为8.9%～19.2 %，较EMS（5.7%）单独处理的效果提高了1.5～3.0 倍。此为我国有文献报道的最早的EMS 诱变相关的研究，进入21 世纪后，我国EMS 诱变研究迅速发展。

1 EMS 诱变材料

EMS 诱变可选取的材料十分广泛，除模式作物拟南芥外，几乎涵盖了整个植物界，其中粮食类作物如水稻、玉米、小麦、高粱、荞麦、马铃薯等；经济作物如油菜、大豆、棉花、烟草、木薯、亚麻荠、花生、芝麻、甘蔗、花椒等；蔬菜类如大白菜、冬瓜、黄瓜、苦瓜、茄子、芥菜、番茄、卷心菜、豇豆、山药、紫苏等；水果类如西瓜、猕猴桃、甜橙、草莓、菠萝、越橘等；花卉类如兰花、长春花，蓝花丹等；树木类如杨树等；草类如狗牙根、黄花苜蓿、蒺藜苜蓿、扁蓿豆、红豆草、多枝赖草、高羊茅等，药用植物如党参等；菌类如枯草芽孢杆菌、酵母等；藻类如三角褐指藻、小球藻等；甚至于原生质体也已成为EMS 诱变的材料。

2 诱变方法

采用EMS 诱变的方法较多，包括种子诱变、花粉诱变、离体诱变等[7]，诱变的部位也因植物种类而异。研究者通常根据作物的繁殖方式和染色体倍数来选择诱变的部位，比如种子、花药、花粉、块茎和叶片等。一般作物的化学诱变最常用的供试材料是种子和花粉，也可采用愈伤组织。诱变材料的处理途径根据供试材料的不同有所差别，常用的途径有浸泡法（种子、芽）、滴液法（茎）、注射法（花器）、涂抹法（花丝、茎）和共培养法（根、花药）等[8]。

不同的物种对EMS 的敏感程度不同，对 EMS 的浓度、处理温度和处理时间的反应效应也不同，必须通过预备试验来确定EMS 诱变的最佳剂量[9]。另外，同一物种不同的组织或器官对EMS 的敏感程度也不一样，因此，无论采用哪种诱变方法，以什么物种、组织或器官作为供试材料，都需要先设置一系列梯度的浓度和时间进行处理，然后从中选用最适宜的诱变剂量（诱变剂量=诱变液浓度×处理时间），最佳诱变剂量取决于EMS 诱变浓度和处理时间的组合[8]。一般情况下，EMS 浓度越低，处理时间越短，对供试材料产生的生物学损伤越小，诱变率也越低，随着 EMS 溶液浓度的提高，诱变率相对增加，对供试材料产生的生物学损伤也随之变大，若致死率过高，则诱变失去意义。因而在确定最佳诱变剂量时，既要保证对种子不会损伤过大，又能获得较丰富的变异。目前，普遍采用半致死剂量进行大量诱变处理，再通过后代筛选获得突变体。

2.1 种子诱变

种子作为植物繁衍后代最主要的器官，成为EMS 诱变处理最主要的材料。用EMS 处理植物种子操作简单，受外界环境因素影响小，且容易获得较大的突变体群体[9]。目前采用种子进行诱变的报道较多，材料涉及面广，包括粮食作物、经济作物、蔬菜、水果花卉等。谭义川等[10]采用20% PEG-6000 室内模拟干旱环境对EMS 化学诱变获得的19 份玉米M4 代诱变系进行干旱胁迫，筛选出4 个抗旱性较好的诱变系。张贞彩等[11]通过对1.2%EMS 处理的济麦20、济麦22 诱变群体M3 单株种子理化特性的分析，发现2 个小麦品种诱变材料糊化粘度变异程度、变化趋势均不同，可形成不同品质、不同功能的淀粉材料，为小麦淀粉品质改良提供了理论和材料基础。杜园园等[12]采用EMS 处理大豆品种长豆18 和黑豆品种长豆006种子，结果表明长豆18 的适宜诱变条件以浸种4 h，EMS 处理浓度0.5%，诱导时间8 h 和浸种4 h，处理浓度0.5%，EMS 诱导时间12 h 处理最优；黑豆品种长豆006 的适宜诱变条件为浸种4 h，处理浓度0.5%，EMS 诱导时间为8 h。

2.2 花粉诱变

花粉诱变是获取突变体的另一有效途径。利用EMS 进行花粉诱变最早始于国外，1986 年，美国ICI种子公司Greaves 等用含有EMS 的石蜡油处理玉米自交系成熟花粉，获得抗除草剂突变体。1991 年张铭堂利用EMS 处理玉米花粉，发现糯质基因WX 的诱变频率为 0.12%，后来蒙坦拿大学从Victor Roboy EMS花粉诱变后代中选出2 个高油突变体[13]。此后，国内一些育种单位逐渐意识到EMS 花粉诱变技术的重要性，并相继开展了相关研究。陈绍红等从1998 年开始，以农大108 玉米为材料，将其花粉用石蜡油进行悬浮处理，经M1 代测定，于2001 年获得高油突变体15 个。刘治先[14]用EMS 花粉诱变技术筛选出两类高油酸玉米突变体，为特用玉米育种和遗传研究提供了可贵的材料。

2.3 离体诱变

离体诱变处理的对象包括原生质体、单细胞、愈伤组织、悬浮细胞、小孢子单核靠边期的花药、茎尖或顶端分生组织、处于分生发育初期的腋芽，以及植物组织或器官的外植体等。国内外已有较多对植物进行EMS 离体诱变研究的相关报道，主要涉及果树和花卉等领域，所研究植物包括木薯、草莓、海棠、党参、花生、兰花、水仙、甜叶菊、唐菖蒲等。石淑稳等[15]用0.2%和0.25% EMS 处理小孢子胚状体3～5 h 均可获得突变体。和江明等[16]用EMS 溶液和秋水仙素先后处理甘蓝型油菜的小孢子，得到了一份油酸含量达80%以上的高油酸突变材料。陆荣生等[17]用EMS 处理木薯品种“桂热-893”组培苗叶片产生的愈伤组织，通过在愈伤增殖、分化及生根培养基中添加一定浓度的草甘膦作为选择压力，进行抗草甘膦植株离体筛选，共获得5 个抗草甘膦无性系，其中2 个无性系对草甘膦有明显抗性。与传统的诱变育种相比，离体诱变可在短期内加强个别性状的变异，提高变异频率和扩大变异范围，并可使诱变、选择、快繁同时进行，使诱变技术更为有效[18]。

2.4 理化复合诱变

理化复合诱变是指利用 2 种或2 种以上物理、化学因子依不同处理顺序处理植物材料进行诱变。其常用的方式为先辐照植物种子，再用含有化学诱变剂的溶液浸泡。复合诱变可采用多种物理、化学组合因子进行处理，其中以γ 射线+EMS 复合处理为最常用的组合方式[19]。由于射线改变了生物膜的完整性和渗透性，从而有助于化学诱变剂的吸收。已有试验证明，适宜的复合诱变及其剂量组合具有明显的累加效应或超累加效应(协合效应 )。刘艳萌等[20]以“全明星”草莓组培苗为试材，分别用甲基磺酸乙酯（EMS）、60Co-γ 射线以及Co-γ 射线+ EMS 的复合诱变剂对叶片进行处理，并对“全明星”草莓进行初步耐盐筛选，结果表明，复合诱变处理再生植株的生物产量和耐盐性显著高于其他处理。熊大胜[21]等用γ 射线及EMS诱变三叶木通种芽，发现二者复合处理能产生早实变异，童期13 个月，比对照缩短12 个月以上，也能产生早熟变异，比对照缩短2 个月以上。Arumugam 等[22]以γ 射线与 EMS 复合处理大麦种子，得出大麦类型SMV-2 比K-168 对复合处理更敏感。邓占鳌等[23]用γ射线和EMS 诱变柑桔，获得了“锦橙”和“桃叶橙”的耐盐突变系。

3 EMS 诱变效应分析

EMS 化学诱变可诱发任意一个基因位点发生突变，即诱变具有非定向，因此其对植物产生的影响几乎涉及植物的所有组织和器官，从表观上来看，植物从内到外、从上到下的特征特性都有可能发生改变。

EMS 诱变使植物产生的变化多种多样。从表1 可以看出，通过EMS 诱变后，植物的茎、叶、花、果实、种子、卷须、发育期等都可发生明显的变异。相比于其他器官，叶、花、果实突变频率较高，且变异类型十分丰富。叶部的突变涉及叶的形状、颜色、形 态等，其中叶的黄化突变产生频率较高，如冬瓜、西瓜、辣椒等都有产生。花的突变涉及颜色、形状、以及育性，果实的突变涉及果实颜色、形状、形态等。目前，尚未见有根部突变的相关报道，原因可能是根部器官在研究中暂时未作为重点引起关注，也可能其本身发生变异概率小，且根系生长于土壤中不易被观察。

从EMS 诱变引起的这些突变性状来看，多数突变对于实际生产应用没有太大的意义，其中很少一部分能直接作为育种材料使用，但这些突变材料却能为植物种质资源创造、突变体库建立、功能基因组学研究等方面发挥重要作用[24]。

表1 EMS 诱变产生的植物不同部位突变表型分类

4 我国EMS 诱变研究进展

论文在很大程度上能直观反映学术研究的进展，包括在各类期刊发表的论文和研究生学位论文等。同时，发明专利也能从一定的侧面反映科学研究的进展程度。笔者对1989 年以来国内发表的EMS 相关的论文和专利进行了统计，如图1 所示。早期进行EMS研究较少，2000 年之前发表的相关论文不超过30 篇，学位论文研究基本为空白。进入到2000 年以后，随着生物技术的迅速发展，EMS 诱变作为获取新材料最短平快的方法被广泛利用，发表的相关论文数量逐年递增，学位论文研究也随之增加。2010 年以后，从事该研究的科研单位与日俱增，论文发表量显著上升，其中仅2015 至2019 年期间就有132 篇与之相关的论文发表，学位论文数量也达到43 篇，专利数量在此期间迅猛增加。从图上数据可以看出，我国20 世纪80 年代末开始进行EMS 诱变起步研究，直到20 世纪末，这期间只有少数单位从事相关研究。进入21 世纪后，从事EMS 诱变研究的单位不断增加，论文发表数目呈直线上升趋势，研究范围不断扩大，研究内容也更加深入。

从文献研究内容来看，早期的EMS 诱变相关研究主要集中于EMS 诱变条件的改良，诱变对农作物性状产生的影响，以及诱变材料的初步筛选等方面，之后逐渐过渡到突变体库的构建，近期的研究则主要倾向于材料筛选后期群体构建、基因定位和遗传转化等。目前，研究者已利用EMS诱变技术，成功构建水稻、辣椒、大豆、玉米、冬瓜、西瓜、甜瓜、黄瓜等突变体库。顾佳清[25]等用EMS 对粳稻品种“中花11”种子进行诱变处理，产生了穗部、籽粒、茎秆、叶片等形态突变，筛选并鉴定出突变体材料861 份，初步构建了突变体库。弭宝彬[26]等研究了处理浓度和处理时间对冬瓜种子萌发和生长的影响，结果表明冬瓜种子最佳诱变条件为1.2%EMS 诱变处理12 h，建立了冬瓜种子EMS 诱变体系，构建了冬瓜突变体库。有研究员对玉米花粉进行诱变，并构建了TILLING 群体，建立了变异丰富的突变体库。

图1 我国EMS 诱变相关论文及专利数据统计情况

5 展 望

EMS 诱变因其操作简便、突变频率高、染色体畸变频率低等优势，被现代育种学研究者广泛应用，EMS 诱变技术的发展推动了植物功能基因组学快速发展，由此诞生了图位克隆技术和定向诱导基因组局部突变技术，后者将传统的化学诱变方法和突变体高效筛选有效结合，具有高通量、低成本的特性，从而大大加快了植物基因组学的研究进程[27]。

与其他育种方法一样，EMS 诱变同样存在局限性，如随机性太强、自身突变效率不高、有益突变少等，因此难以实现真正意义上的定向诱变育种。近年来，分子遗传学研究不断深入，利用基因工程技术辅助育种成为当前研究的热点，尤其是 CRISP 技术，能通过RNA 介导的Cas9 酶切作用，在完整基因组上的特定位点完成切割反应，从而实现对基因组进行高效定点修饰[28-30]。诱变育种适用于隐性基因控制的个别性状改良，若能通过EMS 诱变育种与遗传工程结合，具有十分广阔的前景，譬如离体培养结合离体诱变和离体筛选。利用基因重组技术，便有可能直接对DNA 施加诱变处理，获得离体诱变，实现“定向诱变”。

EMS 诱变可以实现在短期内获得大量的突变体，构建突变体库，具有其他诱变育种方式所不具备的优点，因此常被现代育种学家用于大规模突变研究。目前，学科间的相互渗透已成为当前科学发展的一大趋势，诱变育种学也必定能扬长避短，在与功能基因组学等相邻学科的相互渗透中得到更快的发展。