基于发光细菌的2 种便携式生物毒性检测仪器的性能测试

张琳琳，刘 刚,2，方 俊

（1.湖南农业大学，湖南 长沙 410128；2.中国科学院亚热带农业生态研究所， 湖南 长沙 410125）

近年来，随着水产养殖业的快速发展，水体中毒性物质的丰度和广度不断增加，因此对水体质量的监测成为社会各界广泛关注的焦点[1]。发光细菌法的生物急性毒性检测是以发光细菌为生物受试体，与样品接触反应一定时间后，通过生物毒性传感器来读取样品发光强度变化与无毒性空白对照比值的一种快速、重复性高、误差小的生物急性检测方法[2]，已在多个国家的毒性检测领域应用[3]。由于其独特的生理特性，发光细菌在快速检测水体毒理成分时具备检测周期短、灵敏度高、检测方式便捷、价格低廉等优点[4]。 对于发光细菌种类的选择，国内常用的有明亮发光杆菌、青海弧菌和费氏弧菌，美国环保署推荐的是费氏弧菌[5-6]。这类细菌在正常生理环境下的新陈代谢会产生荧光物质，而当水体中有毒物质含量升高时，发光细菌的呼吸作用就会受到抑制，因此所产生的荧光信号强度会变弱。针对这一特性，便携发光细菌毒性仪只需要检测荧光信号的强弱，就可以对水体毒性做出判断[7-9]。该研究采用同时满足国内外标准的费氏弧菌对市面上最常用的2 种便携式生物毒性检测仪器进行性能测试，以期为毒理检测的仪器选择提供指导。

1 材料与方法

1.1 水样采集

从长沙县松雅湖采集湖库水，从捞刀河镇茶子山村采集地下井水和养殖污水，从长沙恒昌化工厂采集化工废水。不同水样均于2020 年1 月5 日现场采集，用pH 试纸测量水样pH 值，确保其在6.0～8.5 范围内，若不在该范围内，用稀盐酸溶液或稀氢氧化钠溶液中和水样pH 值至7.0±0.2。

1.2 供试设备与试剂

供试生物毒性测定仪分2 种型号，一种为国产Lux-T020 型，一种为美国DeltaTox Ⅱ型；其他设备还有2 mL 玻璃检测池、美国热电移液器（200 μL、1 mL）。主要试剂有费氏弧菌冻干粉（实验室自产），氯化钠、七水硫酸锌、盐酸、氢氧化钠（国药分析纯）和纯净水。

1.3 测试方法与步骤

采用GB/T15441—1995[10]中的方法进行分析测定。（1）打开测试仪器，预热10 min，在黑暗条件下，测试36 次未加样品的本底读值，检测仪器背景信号的稳定性。（2）取2 mL 含3%氯化钠的参比水，分别加入20～280 μL（以20 μL 为一个等级，共设计14个梯度）的费氏弧菌菌悬液，2 台仪器同时检测，比较光电倍增管的曲线变化。（3）取2 mL 含3%氯化钠的样品，加入25 μL 费氏弧菌菌悬液（取1 支在-20℃保存的费氏弧菌冻干粉，加入40 mL 复苏液水合溶解，置于4℃冰箱中，供待测样品使用），菌液与样品的接触反应时间为15 min。水样、阴性质控（纯净水）和阳性质控（2 mg/L 的七水硫酸锌）均平行测定6 次，以相对抑制率来表示毒性大小。

相对抑制率（%）=1-相对发光强度（%）

1.4 数据分析

试验数据采用Excel 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 仪器的稳定性

从表1 可以看出，国产Lux-T020 型仪器的暗计数读值在25～84 S-1之间波动，满足出厂≤200 S-1的要求；而美国DeltaTox Ⅱ型仪器的暗计数读值在4～12 S-1之间波动，满足出厂≤100 S-1的要求。

2.2 2 种生物毒性测定仪光电倍增管的变化曲线

从图1 可以看出，美国DeltaTox Ⅱ型仪器在491043 3～358262 96 S-1之间有较好的线性，国产Lux-T020 型仪器在266 768 4～195 675 43 S-1之间有较好的线性，2 台仪器所用检测器（光电倍增管）的线性范围存在着明显的差异。从图1 中还可以看出，美国DeltaTox Ⅱ型仪器在第8 个点（即添加160 μL 费氏弧菌菌悬液）时，光子量已达到饱和，国产Lux-T020 型仪器的光子量在第10 个点（即添加200 μL 费氏弧菌菌悬液）时达到饱和。

表1 2 台仪器的暗计数读值 （S-1）

图1 2 种生物毒性测定仪光电倍增管的变化曲线

2.3 阴性、阳性质控试验结果

由表2 可知，采用纯净水做参比时，2 台仪器测试得到的相对抑制率在-2.46%～2.94%范围内，均满足仪器设计参数±5%的要求；当以2 mg/L 七水硫酸锌作阳性质控液、以纯净水做参比时，国产Lux-T020型仪器的标准偏差为1.00，美国DeltaTox Ⅱ型仪器的标准偏差为0.67，但美国DeltaTox Ⅱ型仪器获得的相对抑制率比国产Lux-T020 型仪器获得的平均偏高20.28 个百分点。

2.4 4 种水样测试结果

由表3 可知，测试清洁的湖库水，国产Lux-T020型仪器的测试极差为14.3，美国DeltaTox Ⅱ型仪器的测试极差为12.6；测试未受污染的地下井水，国产Lux-T020 型仪器的测试极差为11.5，DeltaTox Ⅱ型仪器的测试极差为4.7；测试养殖污水，国产Lux-T020型仪器的标准偏差1.13，美国DeltaTox Ⅱ型仪器的标准偏差为1.59；测试有毒化工废水，国产Lux-T020型仪器的标准偏差为1.30，美国DeltaTox Ⅱ型仪器的标准偏差为1.03。

表3 不同水样的测试结果 （%）

中国科学院南京土壤研究所将水质毒性分为5 个等级。由表4 可知，2 台仪器在测试清洁的湖库水与地下井水时，毒性级别均为低毒；但测试养殖污水时，国产Lux-T020 型仪器的毒性级别为中毒，而美国DeltaTox Ⅱ型仪器的毒性级别为重毒；2 台仪器在测试化工废水时，毒性级别均为高毒。

3 结 论

试验结果表明，采用费氏弧菌冻干粉，在相同的测试条件下，仪器的暗计数、阴性质控均能达到指标要求。测试较清洁的湖库水和地下井水时，2 台仪器的毒性分级同在低毒级别。通过光电倍增管的线性范围比较得知，2 台仪器所选光电倍增管的型号不同，是造成测试养殖污水时，水样毒性分级不一致的主要原因。水样测试的相对抑制率越高，水样的毒性越强。目前国内环境监测部门使用的便携式毒性仪有各种品牌，各品牌的生物毒性检测模式、所用菌种、光电倍增管各有差异，均会造成测试现场水样的数值和毒性分级不一致。