水稻纹枯病拮抗菌的筛选、鉴定及抑菌活性测定

彭 迪，朱哲远,2，李祖任,2，王立峰，刘 洋，柏连阳,2

（1.湖南省农业生物技术研究所，湖南 长沙 410125；2.湖南农业大学植物保护学院，湖南长沙 410128；3.湖南省水稻研究所，湖南 长沙 410125）

水稻纹枯病由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）侵染水稻所形成，世界各产稻国家均有分布，亚洲稻区危害最为严重，水稻感染后品质出现明显下降，严重时导致绝收[1-2]。该病被归为土传病害，立枯丝核菌等病原菌形态以菌丝或菌核在土壤中越冬，待温度、湿度等条件适宜时会大量生长，在水稻生长中后期随着田间氮肥的过量单一使用，水稻抗病性的降低，病原菌导致水稻感病，从而纹枯病流行爆发[3-4]。解决水稻纹枯病的根本措施是选育抗病品种，但目前还未能筛选到高抗或免疫品种，主要还是通过井冈霉素等化学药剂来防治[5-6]。由于化学药剂的使用存在农药残留超标、环境污染等诸多弊端，加上我国积极推进农业绿色发展，提倡实施高效绿色防控措施，因此结合生物防治进行综合防治的方式成为当今水稻纹枯病研究热点。

拮抗微生物可作为生物防治材料控制水稻纹枯病的发生，近年已有学者发现了抗纹枯病的拮抗真菌、细菌和放线菌[7-10]。芽孢杆菌（Bacillus spp.）是当前研究较广、应用较多的生防菌，它们在生长过程中产生了多种抗菌化合物。Wichitra等报道，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）NSRS 89-24中提取的β-1,3-葡聚糖酶和抗生素能够降解纹枯病原菌等真菌细胞的细胞壁，控制病害的发生[11-13]。卢钰升等[14]从水稻土壤中分离的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）GB58，与常规药剂对比对水稻纹枯病防效提高了24%。游景茂[15]分离的枯草芽孢杆菌WJ-1，能在抑制菌丝生长同时导致菌丝生长畸形、溃解和内部物质泄漏。陈刘军等[16]分离的蜡质芽孢杆菌（Bacillus cerens）AR156对水稻纹枯病温室防效达到73.06%，同时促进水稻生物量增加了14.45%。因此，筛选出抑制病原菌和促进植物生长的细菌是植物病害防治的重要方向。

为筛选出对水稻纹枯病菌的高效拮抗生防菌，湖南省农业生物技术研究所实验室从野外采集并分离细菌菌株，采用划线对峙方法筛选出对水稻纹枯病病菌有抑制作用的短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）B-2，采用纸片扩散法测定菌株对纹枯病菌的室内抑菌活性。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与培养基

1.1.1 供试菌株 待筛菌株为实验室从野外从不同水稻病健植株分离到的细菌菌株，按1∶1与甘油混合存于-20℃冰箱中。靶标菌株为实验室从野外感染水稻纹枯病的水稻叶片表面采集、分离和鉴定的水稻纹枯菌株。

1.1.2 培养基 细菌培养基采用LB液体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、氯化钠10 g，定容至1 000 mL，pH值7.0，用于生防细菌的发酵。真菌、生防平板试验采用PDA培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g，定容至1 000 mL，pH值7.0。

1.2 待筛选菌株发酵液制备

将待筛选菌株按0.5%的量接种于LB液体培养基中，在28 ℃下按200 r/min置于恒温摇床中，振荡培养40 h，得到菌种发酵液。

1.3 拮抗菌筛选

采用划线对峙法筛选对水稻纹枯病菌有生长抑制的细菌菌种，用接种环沾取待筛细菌菌株发酵液1环于已凝固的PDA平板中央划线，划线方式：从平板中央上边缘垂直划一条直线到下边缘。距离中央菌液直线中点左右各6 cm处分别接种水稻纹枯病菌菌碟，设置3个重复和空白对照，空白对照不划待筛菌株线。在25℃培养箱中恒温培养，待空白对照左右菌碟菌丝生长相交，测量水稻纹枯病菌边缘和待筛菌株直线之间抑菌带宽度，筛选出对水稻纹枯病菌抑制效果最好的细菌菌株。

1.4 拮抗菌抑菌活性测定

根据划线对峙法筛选的结果，选择对水稻纹枯病菌抑菌效果最好的细菌菌种，采用K-B纸片扩散法测定细菌菌株的抑菌活性，按照1.2中方法制备细菌菌株发酵液[17]。将活化好的水稻纹枯病菌接种于PDA平板中央，灭菌镊子夹取6 mm无菌滤纸片放置于与中心等距的左右两方。用移液枪吸取10 μL细菌菌株发酵液到滤纸片中央，设置3个重复和空白对照。置于25℃恒温培养箱中培养，测量抑菌圈半径（滤纸片圆心到中央靶标菌盘最边缘菌丝距离）观察抑菌效果。根据公式（1）计算抑菌活性。

1.5 拮抗菌的分子生物学鉴定

采用16S rDNA通用引物对细菌B-2的基因组DNA进行PCR扩增、序列测定和BLAST比对[18]。PCR扩增产物由擎科生物技术有限公司提供并进行序列测定，同源性搜索比对使用NCBI数据库。

1.6 拮抗细菌对水稻纹枯病的田间防治效果

试验地位于长沙县高桥镇，试验田为纹枯病发病较严重的水稻田，水稻品种为农香32。2017年田间试验包括4个处理：拮抗细菌发酵液（含菌量为1×108CFU/mL）；拮抗细菌发酵液（含菌量为5×108CFU/mL）；药剂对照生物农药井冈霉素wp；清水对照。每处理重复4次，共16个小区，每个小区面积为30 m2（6 m×5 m）。各小区按随机区组排列。水稻分蘖末期施药1次，对水750 g/hm2喷雾，至水稻抽穗初期施用第2次，间隔10 d后在水稻齐穗期第3次用药。

调查方法：第3次用药后14 d分别调查各小区的发病情况。每小区调查200株，记载发病株和严重度（计算病株率、病情指数和防治效果）。调查方法按照《农药田间药效试验准则》（一）进行，分级标准如下：

0级：全株无病；1级：第四叶片及其以下各叶鞘、叶片发病（以剑叶为第一片叶）；3级：第三叶片及其以下各叶鞘、叶片发病；5级：第二叶片及其以下各叶鞘、叶片发病；7级：剑叶叶片及其以下各叶鞘、叶片发病；9级：全株发病，提早枯死。

采用邓肯氏新复极差（DMRT）法分析试验数据的差异显著性。

2 结果与分析

2.1 拮抗菌筛选结果

从野外水稻田采集、分离和纯培养得到5株细菌菌株，以水稻纹枯病菌作为靶标指示菌，筛选出有拮抗作用的菌株，其中B-2拮抗效果最好，水稻纹枯病菌外围与中央生防菌株线形成空白区域最广。

2.2 拮抗菌活性测定结果

试验结果显示，经PDA平板对峙培养30 h后，B-2菌株对水稻纹枯病菌的平均抑菌圈半径为1.6 cm（图1），未加入拮抗菌种的对照处理平均抑菌圈半径为0 cm。处理组与对照组差异较为明显，B-2抑菌活性为85.33%，表明B-2菌株对水稻纹枯病菌有较明显的抑制效果。

2.3 拮抗菌鉴定结果

通过分子生物学的方法，经过PCR扩增和公司的测序，将16S rDNA序列提交至NCBI中，用BLAST程序与数据库中已经公开的序列进行同源性比对，结果表明菌株B-2为短小芽孢杆菌。

2.4 拮抗菌B-2防治水稻纹枯田间防治效果

田间小区试验结果表明（表1），短小芽孢杆菌B-2对纹枯病的防治效果较好，相对于清水对照处理，其他3个处理的水稻纹枯病的发病率都有明显的降低，其中5×108CFU/mL浓度的B-2菌悬液处理的发病率最低，对纹枯病的防效达到了72.42%。

图1 拮抗菌B-2对水稻纹枯病菌抑制效果

表1 短小芽孢杆菌B-2防治纹枯病田间试验效果

3 结论与讨论

研究结果表明，B-2在室内平板试验中对水稻纹枯病菌的拮抗抑制作用明显。试验中采取划线对峙法筛选拮抗菌种，通过观察菌株之间空白区域面积，初步判断生防菌株对靶标菌株的拮抗作用，借鉴药敏实验采取的纸片扩散法进一步测定菌株的抑菌活性，这种方法相对其他筛选、鉴定方法快速、方便且准确。

在植物生物防治中，分离的生防菌一般具有对病原菌有拮抗作用外，还对植物具有一定的促生作用[19]。马桂珍等[20]从海洋中分离了细菌L1-9对小麦根腐叶枯病和小麦赤霉病有良好的防病效果，同时能显著提高小麦种子的发芽率和小麦的株高，促进小麦生长。田大伟等[21]研究的促生芽孢杆菌OKB105、FZB42在防治水稻白叶枯病同时使水稻株高增长15.86%，产量提升14%。分离的拮抗菌株B-2经鉴定为短小芽孢杆菌，对水稻纹枯病菌的抑制效果明显，对水稻生长的促生作用还待验证，拮抗菌生长产生激素类物质是促进作物生长的原因之一，可预期估计B-2对水稻生长具有一定的促进作用。

试验中分离的短小芽孢杆菌B-2对水稻纹枯病菌抑制活性高达85.33%，可作为生物防治的有效措施之一，也可作为生物农药开发的重要菌株。开展B-2的分子生物学研究，找到相关功能基因，分析功能基因的作用机制，研究相关的代谢通路表达等，可以为进一步改造出发菌株，使其在大田生防中表现出更良好的防效。通过目前的试验，已经表明B-2有很好的生防应用前景，实验室将进一步开展田间生防试验和菌株基因功能挖掘。

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