碱提法提取栝楼籽蛋白工艺条件的优化

林树花，谭兴和，李高阳，刘 阳

（1. 湖南农业大学食品科技学院，湖南 长沙410125；2. 湖南省农产品加工研究所，湖南 长沙410125）

栝楼，又名吊瓜、瓜蒌、药瓜，属葫芦科栝楼属多年生草本植物，是我国传统常用的中药材，具有扩张冠脉，抗肿瘤、抗菌、抗衰老、抗艾滋病、抑制血小板凝集等功效，对消化系统有预防溃疡和泻下的作用[1]。栝楼籽外表有坚壳，呈深褐色，长椭圆形，籽肉略有涩味，富含油脂、蛋白等多种营养成分[2]。目前，国内外对栝楼籽蛋白提取的研究还少见报道。碱提法作为一种传统的蛋白质提取方法，因其适应性广、成本低、易操作而成为植物蛋白提取的首选方法[3]。因此，试验拟通过正交优化设计，确定碱提法提取栝楼籽分离蛋白的最佳工艺参数，为栝楼籽这一优质蛋白的生产应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试栝楼籽由湖南永州市金腾栝楼发展有限公司提供。试验主要试剂有盐酸、氢氧化钠、硫酸、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、95%乙醇、无水乙醚等，均为分析纯。试验主要仪器有ZK 组织捣碎机（江苏盐城科学仪器厂）、79-1 磁力搅拌器（湖南湘仪科学仪器设备有限公司）、RE-5286A 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、DHG9071A 电热恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）、ES-200 电子天平（长沙湘平科技发展有限公司）、AL204 分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）、DELTA 320pH 计（METTLERTOLEDO）、501型恒温水浴锅（金坛市岸头国瑞实验仪器厂）、TG16-WS 离心机（长沙湘智离心机有限公司）、全自动蛋白质测定仪（福斯）、全自动凯氏定氮消化仪（福斯）、DB-2 不锈钢电热板（北京市永光明医疗仪器厂）、FREEZONE4.5L 立式冷冻干燥机（LABCONCO）。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程 （1）脱脂栝楼籽粉的制备：栝楼籽→去壳→破碎→加入无水乙醚脱脂→过滤→蒸发滤液→烘干→脱脂栝楼籽粉末（以下简称栝楼籽粉）。（2）碱提法制备蛋白的过程：准确称取一定量栝楼籽粉于50 m L 离心管中，按一定固液比加水混匀，用1 mol/L 氢氧化钠调节碱提pH 值，放入水浴锅中，在适宜的温度下浸提一定的时间。然后取出冷却，调节酸沉pH 值，沉淀后于5 500 r/m in 离心15 min，弃上清，取沉淀调pH 值至中性，冷冻干燥得分离蛋白粉。

1.2.2 试验设计 （1）单因素试验设计：①栝楼籽粉粒度大小，在固液比为1︰20，碱提pH 值为9.0，提取温度50℃，提取时间60 m in 的条件下，分别考察过20目、60 目、100 目、140 目、180 目筛对栝楼籽蛋白得率的影响；②酸沉pH 值，在固液比为1︰20，碱提pH 值为9.0，提取温度50℃，提取时间60 m in 的条件下，考察酸沉pH 值3.4、3.6、3.8、4.0、4.2 对栝楼籽蛋白得率的影响；③提取时间，在粒度大小100 目，固液比为1︰20，碱提pH 值为9.0，提取温度50℃的条件下，分别考察40、50、60、70、80、90、100、110 m in 的提取时间对栝楼籽蛋白得率的影响；④提取温度，在粒度大小100 目，固液比为1︰20，碱提pH 值为9.0，提取时间60 m in 的条件下，分别考察30、40、50、60、70℃温度对栝楼籽蛋白得率的影响；⑤固液比，在粒度大小100目，碱提pH 值为9.0，提取温度50℃，提取时间60 m in 的条件下，分别考察1︰10、1︰15、1︰20、1︰25、1︰30 的固液比（w︰v）对栝楼籽蛋白得率的影响；⑥碱溶pH 值，在粒度大小100 目，固液比为1︰20，提取温度50℃，提取时间60 m in 的条件下，分别考察碱溶pH 值8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5 对栝楼籽蛋白得率的影响。（2）正交试验：在单因素试验的基础上以提取时间、提取温度、固液比、碱溶pH 值为考察对象，栝楼籽蛋白得率为响应值，应用L9（34）的正交设计优化碱提法提取栝楼籽蛋白的工艺条件。正交试验因素水平表见表1。

表1 碱提法正交试验因素水平表

1.2.3 测定方法与计算 蛋白质测定（GB 5009.5-2010）采用凯氏定氮法。蛋白质得率计算公式如下：

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 栝楼籽粉粒度大小的选择 从图1 中可以看出，当栝楼籽粉粒度在20～100 目时，栝楼籽蛋白的得率几乎呈线性上升趋势，这是因为目数增加则颗粒越细小，其与溶液接触的表面积越大，反应加快，因此提取率增加；在100 目时，栝楼籽蛋白质的得率达最大值（37.77%）；在100～140 目时，栝楼籽蛋白的得率逐渐下降，这可能是此时的粘度增大，对反应反而形成了阻碍，因而造成提取率下降；而在140～180 目时，栝楼籽蛋白的得率又有所上升。这也许是因为随着目数的增加，单位质量的栝楼籽粉所含蛋白质含量也随之增加。因此，选择100 目作为栝楼籽粉的最适粒度。

图1 栝楼籽粉粒度大小对栝楼籽蛋白得率的影响

2.1.2 酸沉pH 值的确定 等电点法提取蛋白质具有避免蛋白质变性、尽可能减少杂质、缩短工艺流程、降低生产成本等优点[4]。由图2 可知，pH 值在3.4～3.8 范围时，栝楼籽蛋白的得率由26.97%上升至36.29%；当pH 值在3.8～4.0 时，得率有所下降；而在4.0～4.2 时，得率的变化不大。当pH 值为3.8 时，栝楼籽蛋白的得率最高（36.29%），即沉淀所得的栝楼籽蛋白质最多，这是因为蛋白质分子间的静电排斥作用使蛋白质聚集、沉淀、溶解度降低，而大多数食物蛋白质的最低溶解度一般出现在等电点附近[5-6]，因此确定酸沉pH 值为3.8。

图2 酸沉pH 值对栝楼籽蛋白得率的影响

2.1.3 最佳提取时间的选择 从图3 中可以看出，在40～70 m in 时，随着时间的延长，栝楼籽蛋白的得率增加不明显，这可能是因为水温透过离心管传导至样液需要一定时间，故导致这一时间段内栝楼籽蛋白的得率增加缓慢；而当提取时间由70 m in 增加至90 m in时，栝楼籽蛋白的得率陡然增加并达到最大值（36.41%）；而后随着时间的延长得率变化不大。因此，选择90 m in 为最佳提取时间。

图3 提取时间对栝楼籽蛋白得率的影响

2.1.4 最适提取温度的确定 由图4 可知，在20～60℃时，随着提取温度的升高，栝楼籽蛋白的得率几乎呈直线急剧上升；这是由于随着温度的升高，溶液中的分子运动活跃，反应速度加快，因而得率上升显著；在60℃时，栝楼籽蛋白的得率达到最大值（36.73%）；随后，当温度继续增加时，栝楼籽蛋白的得率却快速下降，这可能与部分蛋白质由于高温变性而未能被充分溶解有关。因此，确定60℃为最适提取温度。

2.1.5 最佳固液比的确定 从图5 中可以看出，随着溶液量的增加，栝楼籽蛋白的得率呈现出现上升后下降的趋势，在固液比为1︰20 时，得率达到最大值（35.08%）。因此，选择1︰20 为最佳固液比。

2.1.6 碱溶pH 值的确定 由图6 可知，当pH 值在8.0～8.5 时，栝楼籽蛋白的得率上升趋势不明显；当pH值在8.5～9.0 时，得率急剧上升；随着pH 值的继续增加，得率持续升高，并在9.5 时，达到最大值（35.09%）；当pH 值在9.5～10.5 时，得率有所降低，但降低幅度不大，此时的栝楼籽蛋白得率在30%以上。由此可见，栝楼籽蛋白在强碱环境下更容易溶入水中，故选择pH 值9.5 为最适碱溶pH 值。

图4 提取温度对栝楼籽蛋白得率的影响

图5 固液比对栝楼籽蛋白得率的影响

图6 碱溶pH 值对栝楼籽蛋白得率的影响

2.2 正交试验结果

由表2 可知，各因素对栝楼籽蛋白得率的影响由大到小依次排列为B（温度）＞D（碱提pH 值）＞C（固液比）＞A（提取时间）；各因素的最优水平分别是A1、B3、C2、D3；即碱提法提取栝楼籽蛋白的最佳工艺条件为：提取温度70℃，碱提pH 值10.0，固液比1︰20，提取时间80 min。在此工艺条件下重复试验3 次，栝楼籽蛋白的得率分别是42.89%、46.33%、43.88%，平均得率为44.37%。

表2 正交试验结果

3 结论

试验结果表明，以过100 目筛的脱脂栝楼籽粉为材料，在酸沉pH 值为3.8 的条件下通过碱提法提取其中的蛋白质，最优工艺条件如下：提取温度70℃，碱提pH 值10.0，固液比1︰20，提取时间80 m in，在该工艺条件下蛋白质的平均得率为44.37%。同时，在试验过程中还发现碱提法具有适应性广、成本低、易操作等优点，提取所获得的栝楼籽蛋白能保持其原有的功能特性，可作为食品加工、保健品、食品添加剂等的原辅用料，为栝楼籽的进一步开发利用拓宽了途径。

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