蹄叶橐吾组织培养及快速繁殖技术研究

高国超，黄 楠，廖 萍，徐 娜，姜长阳

（辽宁师范大学生命科学学院，辽宁 大连 116029）

蹄叶橐吾（Ligularia fischeri）又称山紫苑、葫芦七、荷叶七、硬紫苑、马蹄紫苑、土紫苑和水荷叶等，属于菊科橐吾属多年生草本植物[1]，生长于湿地、山坡草地、河岸、灌丛和林下，在我国，主要分布在东北、华北等地，在辽宁的抚顺、清原、宽甸、桓仁、岫岩、本溪、瓦房店、普兰店等地有种植[2]。蹄叶橐吾的根和根茎含有倍半萜类化合物[3-6]，具有祛痰止咳、活血止疼、补虚润肺等功效，能治咳嗽、痰多、咽痛、咳血、肺结核、劳伤、跌打损伤等疾病[6]。由于蹄叶橐吾具有重要的药用价值。多年来，人们一直大量的采挖作为药材，这使本来分布和数量较少的野生蹄叶橐吾越来越少。蹄叶橐吾利用种子繁殖较难，人工种植难度大。为了开发利用蹄叶橐吾这一宝贵资源，解决种植所需种苗问题，人们试图探讨无性系组培技术应用的可能性。虽然目前国内已有蹄叶橐吾组织培养研究的报道[7-8]，但迄今未见有关蹄叶橐吾快速繁殖研究的报道，为此对蹄叶橐吾的组织培养及快速繁殖技术进行了研究，以期为蹄叶橐吾大量种植提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

五月中旬，于普兰店老帽山采集生长旺盛的蹄叶橐吾嫩茎，放入磨口广口瓶中，进行消毒灭菌。其方法详见参考文献9。

1.2 方法

1.2.1 培养条件 详见参考文献9。

1.2.2 嫩茎愈伤组织的诱导培养 将蹄叶橐吾嫩茎切成约0.2～0.3 cm的茎段，接种到含不同浓度激素的MS培养基，在黑暗的条件下进行嫩茎愈伤组织的诱导培养。

1.2.3 分化培养 将继代培养的愈伤组织分散为独立颗粒后，接种到以MS为基本培养基，附加不同浓度激素的培养基上，在光照的条件下进行愈伤组织的分化培养。

1.2.4 试管苗生根培养 将继代培养生长旺盛的不定苗，从基部剪下，接种到以MS、1/2MS、1/4MS、LS、B5、white、N6为基本培养基，分别附加IAA 0.1 mg/L、IBA 0.1 mg/L、NAA 0.1 mg/L、2，4-D 0.1 mg/L的生根培养基上进行生根培养。生根试验重复2次，每种培养基接种培养100个不定芽。

1.2.5 试管苗的移栽与定植 将培养试管苗的培养瓶移到温室中，打开瓶塞，放到较强的光照下炼苗3 d后，把试管苗从培养瓶中取出，移栽到上面铺有一层厚5～7 cm炉灰渣苗的床上。并保持温度15℃以上、湿度90%左右、没有直射光照的环境条件。移栽试验重复2次，每次移栽800株试管苗。把在温室中，5月中旬把移栽成活的试管苗定植到大连郊区水库边的湿地上。定植试验重复2次，每次移栽700株试管苗。

2 结果与分析

2.1 不同激素配比对茎段愈伤组织诱导的影响

茎段接种培养后10 d左右，有的切口张裂，长出淡黄色的愈伤组织，继续培养到50 d时观察，统计结果见表1：在BA浓度为1.5 mg/L时，不论与哪种生长素配合使用，均不易诱导形成愈伤组织。在BA浓度为0.9 mg/L时，虽然都能诱导形成愈伤组织，但诱导率较低。而在BA浓度为0.3 mg/L时，不论是含有不同浓度的NAA，还是含有不同浓度的2，4-D，愈伤组织的诱导率都较高。尤其是在2，4-D浓度为1.5 mg/L的培养基上，不仅愈伤组织的诱导率为82%，而且外观上长势较好。观察还发现，在BA浓度为0.3 mg/L、2，4-D浓度为1.5 mg/L的培养基上，培养到50 d时，所诱导培养出的愈伤组织大小为0.2 cm左右的淡黄色颗粒状。一般认为，这样的愈伤组织为具有分化力的愈伤组织[10]。把这种培养基诱导培养的愈伤组织接种到相同的培养基上进行继代培养，连续继代培养5代，不仅培养的愈伤组织外观上不变，而且生长速度加快，每个继代周期为40 d，颗粒状愈伤组织的增殖率达到了12.4倍。这说明MS+BA 0.3 mg/L+2，4-D 1.5 mg/L的这一培养基是蹄叶橐吾嫩茎愈伤组织诱导培养的理想培养基。

表1 不同激素配比对愈伤组织诱导的影响

2.2 不同激素配比对愈伤组织分化培养的影响

接种后10 d有的培养基上开始分化出不定芽，继续培养到45 d时观察统计。结果见表2，在BA含量为0.6 mg/L，NAA含量为0.1 mg/L的培养基上，不仅愈伤组织颗粒分化率达94%，而且外观上长势好。在此培养基上培养20 d左右，在先已分化芽的芽基部，相继分化出多个不定芽，培养到45 d时，就会分化出带有3～7个不定芽组成的为丛生状不定芽。把分化的不定芽从基部剪下后，接种到相同培养基上进行继代培养，经过40 d培养，继代的不定芽很快就又分化出生长较为旺盛的丛生不定芽，平均单芽的增殖系数为6.2个。经过连续5次的继代培养，其分化率基本不变，但继代培养的不定芽的长势远比直接由愈伤组织分化的不定芽旺盛，几乎没有无效不定芽。这说明MS+BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L这一培养基是蹄叶橐吾愈伤组织和不定芽分化培养的理想培养基。

表2 不同激素配比对愈伤组织分化的影响

2.3 不同培养基及不同浓度激素对生根培养的影响

接种培养到8 d时，有的培养不定芽基部能形成根原基，30 d时观察统计，结果证明：1/2MS+IAA 0.1 mg/L这一培养基的生根效果最好，不仅生根率达到了95.5%，而且试管苗长势好。2次重复试验的结果基本一致。由此证明：1/2MS+IAA 0.1 mg/L这一培养基是蹄叶橐吾生根培养的理想培养基。

2.4 生根试管苗的移栽与扦插

观察表明，移栽后15 d可见成活的试管苗开始生长。30 d时平均移栽成活率为94.6%。定植后30 d平均成活率为98.6%。定植的试管苗初期生长较慢，植株较小，40 d后生长速度加快。7月上旬，与野生的蹄叶橐吾相比，试管苗具有植株整齐、叶色浓绿、根系发达等特点。同时，试管苗保持了野生蹄叶橐吾的所有生物学特性，8月下旬开花，9月下旬果实成熟。

3 讨论

本研究对愈伤组织进行继代培养，40 d为一个培养周期，愈伤组织的增殖率为12.4倍。按此速度，一年能繁殖出12.49个后代；对不定芽进行继代培养，40 d为一个培养周期，不定芽的增殖系数为6.2个。按此速度，一年能繁殖出6.29个后代。仅从数量上看，后者远不及前者，但是由于后者分化的不定芽几乎都是有效不定芽，并且长势旺盛，这更有利于进行生根培养。所以，从加快试管苗生长和更有利于快速繁殖的角度看，应该采用不定芽分化继代培养的方法进行快速繁殖。

在愈伤组织分化培养中，其培养周期为45 d；而在不定芽分化继代培养中，其培养周期为40 d。后者的培养周期比前者缩短了5 d。产生这种现象的原因有三：一是由于不定芽本身储藏的营养比愈伤组织多，更有利于不定芽的分化；二是不定芽本身具有绿叶、绿色嫩茎等器官，在培养中能合成IAA等植物生长调节剂，有利于对自身生长分化的调节，促进了不定芽的分化；三是两者都是在相同的培养基上进行分化培养的，前者是初代培养，需要一个适应过程，而后者是在前者的基础上进行的，对培养基具有更强的适应性。

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[3]杜 娟，李彦肪.蹄叶橐吾化学成分及药理活性之研究进展[J].中国农学通报，2005，21(11)：92-95.

[4]邓美彩，焦 威，董玮玮，等.蹄叶橐吾根的化学成分研究[J].天然产物研究与开发，2009，21(5)：776-778，836.

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[7]陆 艇，卢 婷，宋云惠.蹄叶橐吾和窄叶橐吾的组织培养技术研究[J].宁波农业科技，2010，(3)：15-18.

[8]杜 娟，杨柏明，李彦舫.蹄叶橐吾的组织培养及植株再生[J].植物生理学通讯，2006，42(4)：7687.

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[11]丰 锋，李洪波，李映志.《植物组织培养》实验教学改革与实践[J].安徽农业科学，2010，（23）：12858-12860.