海洋活性酵母YS－185破壁技术的研究

郝建华，王跃军，刘均忠，孙 谧

（中国水产科学研究院黄海水产研究所海洋酶工程室，山东 青岛 266071）

红酵母不仅含有丰富的蛋白质、维生素，而且还能产生胡萝卜素、虾青素等天然物质[1]。这些丰富的蛋白质、纤维素和色素类物质在红酵母生长代谢过程中都积累在细胞内。红酵母具有结构复杂的细胞壁[2-4]，影响细胞内物质的释放，其细胞壁对提高酵母利用率十分重要。目前已报道的破壁方法有物理破壁[5]、化学破壁[6]、生物破壁[7-11]等方法，这些破壁方法有各自的优缺点。本研究以一株自行分离的海洋红酵母为试验材料，采用酸碱法、珠磨法和酶溶法对其进行破壁处理，探讨其破壁效率，以期为将来高效利用海洋红酵母提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

海洋活性酵母YS-185，894碱性蛋白酶（活力单位13万U/g），中国水产科学研究院黄海水产研究所海洋酶工程室保存。

1.2 主要仪器

离心机：LC-6M型（上海市离心机械研究所）；752型紫外光栅分光光度计（上海分析仪器总厂）；BIOPHOT型Nikon相差显微镜（日本尼康公司）；Motics SFC-18型生物显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；恒温水浴锅（北京西城区医疗器械厂）；KDL型珠磨机（瑞士WAB公司）。

1.3 酵母细胞酸碱法破壁

酵母细胞悬浊液在pH值3时于55℃处理36 h，然后将pH值调至12，继续处理24 h，离心收集不容沉淀物，水洗2～3遍，喷雾干燥得酵母细胞壁。其中离心速度和时间均为400 r/min，15min。

1.4 酵母细胞珠磨法破壁

将培养好的海洋酵母细胞离心收集，取100 mg湿酵母细胞（干重约为15 mg）用冷去离子水清洗3遍后，移于试管中使其悬浮于浓度为0.1 mol/L、pH值为8.0的0.5 mL磷酸缓冲液中，按1∶1质量比的比例添加玻璃珠，然后在漩涡混合仪上振动，处理时间分别为1、2、3 h，并隔一段时间用冰浴进行降温。处理后的酵母细胞用冷去离子水清洗3遍，喷雾干燥得酵母细胞壁。

1.5 酵母细胞酶溶法破壁

在55℃下，酵母自溶6 h后，按400 mg/100g酵母液的添加量添加894碱性蛋白酶，pH值调至10.0于37℃下继续酶解9 h后，煮沸5 min灭酶活，离心，水洗2～3遍，喷雾干燥得酵母细胞壁。

1.6 酵母细胞破壁率的评价

酵母细胞破壁率按公式α＝N1/（N1+N2）×100%计算。其中：α为酵母细胞破壁率；N1为显微镜下非正常形态的细胞数；N2为显微镜下形态正常的细胞数。在测定的时候随即选取10个视野，进行平均。

2 结果与分析

2.1 酸碱法破壁效果

酸碱法破壁虽然试验步骤简单易操作，但效果不理想，且一个操作周期比较长，生产中不宜采用此法进行破壁。从图1中可知，细胞经酸碱处理后无明显变化，基本保持原形态，破壁率在10%左右。

图1 酸碱法处理后的海洋酵母细胞

2.2 珠磨法破壁效果

珠磨法破壁选择处理时间分别为1、2、3 h，机械破壁比较剧烈，能将细胞壁破碎，可以得到大小不一的细胞壁碎片，珠磨3 h后的酵母细胞破碎率比较高，碎片较多，显微镜下观察珠磨法破碎海洋酵母细胞效果如下。

由图2可以看出，珠磨破碎细胞1 h后，细胞部分破碎，细胞壁被处理成碎片，但破壁率不高（图2-A）。珠磨2 h的破壁效果明显好于前者，显微镜下观察到的完整的酵母细胞已经减少，碎片增多（图2-B）。珠磨3 h后显微镜下观察到的酵母细胞的完整细胞基本观察不到，碎片比前两者更多，破碎程度比较剧烈，破壁率为85%（图2-C）。

图2 珠磨法处理后的海洋酵母细胞

2.3 酶溶法破壁效果

酶溶法对海洋活性酵母进行破壁，破壁效果较好。从图3中可以看出，海洋酵母细胞已完全破壁，细胞已成空壳，但仍保持原形态，未被解离成碎片，破壁率为80%左右。

图3 酶溶法破壁处理后的酵母细胞

3 讨论

酸碱法、酶溶法、珠磨法对海洋酵母YS－185的破壁结果各异：经酸碱法处理后的细胞破壁效果不佳，细胞基本保持原形态；酶溶法破壁率可达80%左右，破壁效果比较理想；珠磨法破碎程度较强，效果较好，所得碎片大小不一，但此种方法只适用于实验室规模的细胞破碎，且后处理工作复杂，对于中试规模的批量生产采用此种方法不太合理，设备耗损太大，而且珠磨法所需设备尚不能国产，需要进口，较为昂贵。因此，从操作规模、生产设备的限制、生产成本以及后处理工作等因素综合考虑，酶溶法对海洋酵母细胞进行破壁不仅效果理想，而且将来在大规模生产中也是可行的。

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