金钱草、白玉兰总黄酮的提取及体外抗氧化性研究

时间：2024-05-25

任雪峰，吴冬青，安红钢，林敏，杨扬

（河西学院化学系，甘肃张掖 734000）

黄酮类化合物广泛存于与蔬菜、水果、牧草和药用植物中，是植物长期在自然选择过程中产生的一些次级代谢产物，是人体必需的营养素之一，许多植物的叶、皮、根和果实中都含有一定量的黄酮类化合物[1]。20世纪20年代，国外把槲皮素、芦丁用于临床后，才引起人们的关注。60年代末，人们发现黄酮类化合物有抗炎、抗病毒、利胆、强心、镇静和镇痛等作用。到70年代，又发现它们有抗氧化、抗衰老、免疫调节和抗肿瘤等作用[2]。

金钱草（Herba Lysimachiae）主要为报春花科（Primulaceae）植物过路黄（Lysimochia christinae Hance）的干燥全草，于夏、秋二季采收，除去杂质晒干备用，全国大部分地区均产，主产于四川。金钱草味甘、咸，性微寒，入肝、胆、肾、膀胱经，具有清热消炎，利尿通淋，排除结石之功效。现代研究表明，金钱草总黄酮具有预防草酸钙结石形成和复发的作用，还有显著的抗炎、增加冠脉血流量等作用[3]。金钱草既可单用，也可与其他药物相配组成复方，较为广泛地运用于临床治病[4]。金钱草含有碱性成分，以黄酮类、甙类、鞣质、挥发油、氨基酸、胆碱、甾醇、氯化钾、内酯类、苷类、槲皮素、山萘酚等物质为主。其中，以黄酮类成分的研究较为深入[5-7]。

白玉兰（Magnolia denudata）为木兰科（Magnoliaceae）木兰属（Magnolia），别名木兰、白玉兰、望春花，主要分布在我国浙江、安徽、山西、湖南、湖北、贵州、广东等省，是重要的绿化、园林美化、传统中药材及香精原料树种，在我国有两千多年的栽培与药用历史。在2000年版的中国药典中，将望春玉兰（Magnolia biondii Pamp.）、玉兰（Magnolia denudata Desr）或武当玉兰（Magnolia sprengeri Pamp.）的干燥花蕾作为中药辛夷的正品[8]。花蕾可入药，性温味辛，归肺胃经，具有散风寒、通鼻窍之功能，用于外感风寒，头痛鼻塞，鼻渊、浊涕常流等症[9]。

试验采用常温浸提法、回流提取法、微波提取法和超声波提取法等4种不同方法，分别对四川产金钱草、甘肃产白玉兰进行黄酮类物质的提取和测定，并对微波提取法所得总黄酮提取液进行体外抗氧化性研究。

1 材料与方法

1.1 供试材料

金钱草，2007年购于四川省德阳市；白玉兰，2007年采于甘肃省兰州市。上述原料洗净后，自然风干，粉碎，过60目筛，备用。

1.2 主要试剂

芦丁（生化试剂，中国国药集团上海化学试剂有限公司）、邻二氮菲、双氧水、硝酸铝、亚硝酸铝、氢氧化钠、乙醇、磷酸缓冲液（PBS）、硫酸亚铁、六氰合铁化三钾、三氯乙酸（TCA）、三氯化铁等试剂均为国产分析纯，蒸馏水。

1.3 主要仪器

WFJ-2100型可见分光光度计（尤尼柯仪器有限公司）；KQ-8型玻璃仪器气流烘干器（郑州长城科工贸有限公司）；SHB-Ш循环式多用真空泵 (郑州长城科工贸有限公司)；G8-204分析天平(上海精科天平)；FW117多功能中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；国华HH-6型数显恒温锅（常州国华电器有限公司）；LDZ4-0.8A低速自动平衡微型离心机（北京医用离心机厂）；DL-180J智能超声清洗器（上海之信仪器有限公司）；LG烧烤型微波炉[乐金电子（天津）电器有限公司]；RE-52旋转蒸发器（上海青浦泸西仪器厂）。

1.4 试验方法

1.4.1 金钱草、白玉兰中黄酮提取方法（1）常温浸提法提取。分别称取金钱草、白玉兰粉末各5.000 0 g，置于锥形瓶中，加入80%乙醇50 mL，在室温下浸提24 h，减压抽滤后蒸发一定量的乙醇；将滤渣重复以上方法进行第2次、第3次浸提，合并滤液定容到100 mL，冰箱中储藏备用。（2）回流提取法提取[10]。分别称取金钱草、白玉兰粉末各5.000 0 g，置于锥形瓶中，加入80%乙醇50 mL，常温浸泡2 h后置于回流装置中，回流提取2 h，减压抽滤后蒸发一定量的乙醇；重复操作两次，其余操作同（1）。（3）超声波法提取[11]。分别称取金钱草、白玉兰粉末各5.000 0 g，置于锥形瓶中，加入80%乙醇50 mL，常温浸泡2 h后在室温下超声处理30 min，超声功率为90 W。重复操作两次，其余操作同（1）。（4）微波提法提取[12]。分别称取金钱草、白玉兰粉末各5.000 0 g，置于锥形瓶中，加入80%乙醇50 mL，温室浸提2 h后，微波低火提取3 min，冷却，抽滤，滤渣进行第2次、第3次微波提取，合并滤液并浓缩定容至100 mL，备用。

1.4.2 黄酮总量的测定[13]（1）对照品溶液的制备。精密称取芦丁对照品30.000 0 mg，用80%乙醇微热溶解后，置于50 mL容量瓶中，用同浓度的乙醇定容。精密吸取已配好的芦丁溶液20.00 mL，再用乙醇定容至50 mL，摇匀，即得浓度为0.240 0 mg/mL的芦丁对照液。（2）标准曲线的制备。精密吸取芦丁对照液 0.00、0.20、0.60、1.20、1.80、2.40、3.00、3.60 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加水补至4.00 mL，再加入5%亚硝酸钠0.40 mL，摇匀，放置6 min，加入 10%Al（NO3）30.40 mL，摇匀，放置 6 min，然后加入5%氢氧化钠溶液4.00 mL，补水至刻度，放置10 min后，在510 nm下测定其吸光度值（以试剂空白作参比），以芦丁浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标作图。（3）清除羟基自由基能力的测定[14]。准确移取0.5 mL 5 mmol/L邻二氮菲溶液置于10.00 mL容量瓶中，再加入2.00 mL pH值7.40的PBS溶液，混匀后加入1.00 mL 7.5 mmol/L硫酸亚铁溶液，加入1.00 mL 2%过氧化氢溶液，补水至10 mL，置于37℃水浴下加热反应1 h后，在536 nm处测得吸光度值为A损伤。同上法，加入样品液后再加1.00 mL 2%过氧化氢溶液，测得A加药。同上法，不加入过氧化氢和样品液测得A未损伤。羟基自由基清除率C的计算方法见以下公式。提取物还原力的测定－普鲁士兰法[15]。准确移取不同量的样品液，分别加入0.2 mol/L pH值6.60的磷酸盐缓冲液和浓度为1%的K3Fe（CN）6溶液各2.50 mL并混合均匀，混合液在50℃水浴中保温20 min，加入2.50 mL 10%的TCA溶液，混合后在3 000 r/min的离心机上离心10 min。取上层清液2.50 mL，加入2.50 mL蒸馏水和0.50 mL 0.1%的FeCl3溶液。测定反应液在700 nm处的吸光度值，用吸光度的大小表示还原力的强度。

2 结果与分析

2.1 标准曲线与回归方程

芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线

2.2 提取物中的黄酮总量

精密吸取一定体积的样品储备液，根据1.4.2（2）的方法测定样品液在510 nm处的吸光度值，代入回归方程，计算出样品中的黄酮含量，结果见表1。

表1 四种总黄酮提取方法结果比较

结果表明，常温浸提法、回流法、超声波法、微波法这4种方法中，微波法提取金钱草、白玉兰中黄酮类物质的量最多。

2.3 提取物清除羟基自由基的能力

精密吸取一定体积的样品备用液，根据1.4.2（3）的方法测定样品液在536 nm处的吸光度值，计算其清除率，结果见图2。

由图2可知，微波法所得提取液对羟基自由基的清除能力随着提取液浓度的变化而变化。金钱草提取液在体积为0.8 mL时出现最大值，测得其对羟基的清除率为81.66%，再增加提取液体积时清除率开始下降；白玉兰提取液在体积为0.70 mL时出现最大值，测得其对羟基的清除率为58.40%，再增加提取液体积时清除率开始下降。

2.4 提取物还原力的测定

精密吸取一定体积的样品备用液，根据1.4.2（4）的方法测定样品液在700 nm处的吸光度值，计算其还原力，结果见图3。

图3 提取液的还原力

由图3可知，微波提取法所得提取液还原能力随着提取液浓度的变化而变化。金钱草提取液在体积为0.50 mL时出现峰值，测得其还原力为0.844，再增加提取液体积时发现还原力减弱；白玉兰提取液在体积为0.60 mL时也出现峰值，测得其还原力为0.832，再增加提取液体积时还原力减弱。

图2 提取液清除羟基自由基的能力

3 结论

（1）用常温浸提法、回流法、超声波提取法和微波提取法提取金钱草、白玉兰中总黄酮类化合物，其中以微波提取法所得总黄酮含量最多，提取率分别为6.032 8 mg/g、36.713 6 mg/g；常温浸提法所得金钱草、白玉兰中的总黄酮含量最少，提取率分别为 4.177 7 mg/g、23.163 2 mg/g。（2）采用邻二氮菲-Fe2+-H2O2体系分光光度法测定金钱草、白玉兰中总黄酮提取液清除羟基自由基的能力的结果表明，二者对羟基自由基均有不同程度的清除能力，清除率与提取液用量成正比，金钱草、白玉兰清除·OH的最佳用量分别1.60、0.70 mL，清除率分别为81.66%、58.40%。（3）采用普鲁士蓝光度法测定金钱草、白玉兰提取液的还原能力的结果表明，金钱草、白玉兰的总黄酮提取液均具有较强的还原能力，其还原能力分别为0.844与0.832。

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