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HPLC法检测药用白花泡桐熊果酸及木犀草素的含量

时间:2024-05-25

李 科,吾鲁木汗·那孜尔别克,陈功锡,姚福成,恩特马克·布拉提白

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院,湖南 吉首 416000;2.湘西宏成制药有限责任公司,湖南 吉首 416000)

泡桐属植物(Paulownia)有毛泡桐(P.tomentosa),兰考泡桐(P.elongata),楸叶泡桐(P.catapifolia),白花泡桐(P.fortunei),台湾泡桐(P.kawakamii),川泡桐(P.fargesii)和南方泡桐(P.australis)等 7个种。除东北北部,内蒙古,新疆北部,西藏等地区外,泡桐在全国均有分布,是我国重要的速生用材树种之一。赵留振用泡桐的叶、花、皮和根有效地治疗人体冻疮、下肢溃疡、风鹤膝风、蜂螫伤、骨折和肩炎等外科常见病,暗示了泡桐的叶、花、皮和根等组织器官可能含有具有治疗作用的次生代谢产物[1]。李晓强等采用硅胶色谱层析柱和波谱分析从白花泡桐叶中分离鉴定出洋芹素(Ⅰ)、木犀草素(Ⅱ)、橙皮素(Ⅲ)、柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖苷(Ⅳ)、熊果苷(Ⅴ)、4-羟苄基-β-D-葡萄糖苷(Ⅵ)、落叶酸(Ⅶ)、1-乙酰基-2-(3′2羟基)十八烷酸甘油酯(Ⅷ)等8种新的化合物[2]。张培芬、李冲用硅胶柱色谱和聚酰胺柱色谱从白花泡桐花中分离纯化次生代谢产物,经波谱分析鉴定出11种黄酮类化合物[3]。陈保红和李寅超以卵蛋白致敏的引喘小鼠为动物模型,观察泡桐花精油对小鼠哮喘气道炎症的抗炎作用,结果表明,泡桐花精油对哮喘鼠气道过敏性炎症具有较好的抗炎作用[4]。Kassi等用MTT法、流式细胞术和蛋白印迹等方法检测熊果酸对细胞活性和细胞凋亡的影响,结果表明,熊果酸显著地抑制了PC-3和LNCaP等癌细胞的增殖,并导致了PC-3和LNCaP等癌细胞的凋亡[5]。Kim等用ELISA、RT-PCR和电泳运动转移等技术检测金银花木犀草素对人结肠上皮细胞HT29合成IL-8的作用,结果表明,木犀草素通过封锁结肠上皮细胞有丝分裂原激活蛋白激酶的磷酸化、降解I-κB和活化NF-κB等途径抑制肠上皮细胞分泌IL-8的作用[6]。湖南湘西宏成制药有限责任公司以白花泡桐叶为原料研发“复方桐叶烧伤油”,其国药准字为Z20063825,临床试验结果证实,该药物对烧烫伤具有很好的效果。上述国内外研究结果表明,白花泡桐的叶、皮、根、花等组织器官含有熊果酸、木犀草素等多种生物活性的次生代谢产物,可制成抗癌、抗菌和抗感染的药品。目前,国内外有关湖南湘西白花泡桐叶中熊果酸和木犀草素含量比较的报道尚未出现。本文采用高效液相色谱法,对湖南湘西宏成制药有限责任公司4个中药种子繁殖基地白花泡桐叶中熊果酸及木犀草素含量进行测定,以期为白花泡桐药材质量标准的建立提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器与材料

岛津系统高效液相色谱仪:包括SPD-20A检测器,LC-20AT双泵;Metiler Toledo AG285型电子天平;150 mL索氏提取器;步琪R-210型旋转蒸发仪。

熊果酸、木犀草素标准品(含量>98%)购自贵州迪大科技有限责任公司;甲醇为色谱纯,购自天津恒兴公司;乙醚、石油醚、乙酸均为分析纯。检测样品取自湘西宏成制药公司4处原料基地,对照样品采自吉首大学新校区,所有样品经吉首大学生物资源与环境科学学院张代贵老师通过形态学鉴定为白花泡桐。

1.2 试验方法

1.2.1 熊果酸色谱条件 按照Chen等报道的方法[7]对熊果酸色谱条件进行检测。色谱柱:Shim-Pack C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流动相:甲醇-水-乙酸(85∶15∶0.5);检测波长:210 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;理论板数不低于 6 000。

在上述条件下,将熊果酸对照品和白花泡桐样品分别进行测定,色谱图见图1-A和图1-B。

图1 熊果酸对照品和白花泡桐样品的高效液相色谱仪图谱

1.2.2 木犀草素色谱条件 参照邸多隆等的方法[10]对木犀草素色谱条件进行检测。色谱柱:Shim-Pack C18柱(4.6 mm×150mm,5 μm);流动相:甲醇-水-乙酸(55∶44∶1);检测波长:350 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;理论板数不低于 6 000。

在上述条件下,将木犀草素对照品和白花泡桐样品分别进行测定,色谱图见图2-A和图2-B。

图2 木犀草素对照品和白花泡桐样品的高效液相色谱仪图谱

1.2.3 对照品溶液的制备 取熊果酸对照品10 mg,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,制成1 mg/mL的熊果酸对照溶液。取木犀草素对照品10 mg,置于10 mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容至刻度,摇匀,制成1 mg/mL的木犀草素对照品存储液,再用甲醇稀释10倍,制成0.1 mg/mL的对照品溶液,备用。

1.2.4 供试品溶液的制备 参照黄丽霞等的方法[8]制备熊果酸样品。取白花泡桐叶片细粉约0.5 g,精密称定,置于索氏提取器中,加乙醚适量,连续回流提取6 h,滤液挥干溶剂,残渣用石油醚(30~60℃)浸泡2次,每次20 mL,浸泡约2 min,倾去石油醚液,残渣加甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶,摇匀,定容,用0.45μm微孔滤膜过滤,取继滤液作为供试溶液。

参照邸多隆等的方法[9]制备木犀草素样品。取白花泡桐叶细粉约0.5 g,精密称定,加50 mL甲醇,超声波提取(功率240 W,频率 50 kHz)1.5 h,滤液挥干溶剂,残渣用石油醚(30~60℃)洗4次,每次10 mL,倾去石油醚,残渣加甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶,摇匀,定容,用0.45μm微孔滤膜过滤,取继滤液作为供试溶液。

2 结果分析

2.1 标准曲线绘制

分别吸取 1、3、5、10、15 μL 的熊果酸对照品溶液,按已定色谱条件进样,测峰面积积分值。以对照品的进样量(X)为横坐标,峰面积积分值(Y)为纵坐标绘制标准曲线。结果表明,熊果酸浓度在1~15 μg的范围内线性关系良好,回归方程为Y=0.020 6 X-0.466 6,R=0.999 0。

分别吸取 1、3、5、7、10 μL 的木犀草素对照品溶液,按已定色谱条件进样,测峰面积积分值。以对照品的进样量(X)为横坐标,峰面积积分值(Y)为纵坐标绘制标准曲线。结果表明,木犀草素浓度在0.1~1μg的范围内线性关系良好,回归方程Y=0.020 1 X+0.002 0,R=0.999 0。

2.2 精密度测试

分别取对照品,按照已定的色谱条件连续进样5次,测得熊果酸、木犀草素峰面积RSD值分别为0.84%、0.92%,表明仪器性能良好。

2.3 重复性试验

取同一样品组的待测样品,平行制备5份,按照已定的色谱条件进样,分别测定峰面积,测得熊果酸、木犀草素的峰面积RSD值分别为1.69%、1.61%,表明该方法重复性良好。

2.4 稳定性试验

取同 1 份供试品溶液,在 0、2、4、8、12、24 h 分别进样,每次进样10 mL,测得熊果酸、木犀草素的峰面积RSD值分别为1.85%、1.73%。这表明供试溶液在24 h稳定性良好。

2.5 回收率试验

精密称取已知含量的一组样品各0.25 g,共5份,分别精密加入相应含量的对照品,按1.2.4的方法制备供试品溶液,根据已定色谱条件进行测定。结果表明,熊果酸、木犀草素的平均回收率分别为96.1%、96.5%,RSD值分别为1.47%和1.65%。

2.6 样品含量测定

不同产地的样品按照1.2.4的方法制备供试品溶液,分别平行三次取样,根据已定色谱条件进行测定。结果表明,4号基地白花泡桐叶中熊果酸和木犀草素含量显著高于其他3个基地白花泡桐(表1)。

表1 不同基地白花泡桐叶中熊果酸和木犀草素的含量比较 (n=3)

3 小结与讨论

本文建立了通过HPLC来检测药用白花泡桐中熊果酸和木犀草素含量的方法,此法具有简单、灵敏、准确度高以及重复性好的特点,可以用于药用泡桐叶片原料选取的控制。

熊果酸为五环三萜类化合物,极性较弱,所以采用甲醇作为流动相。起初实验发现用甲醇与水按85∶15的比例配制流动相即可将熊果酸与相邻成分有效分离,但其峰型稍有前展,所以加入乙酸进行测试,发现加入0.5%的乙酸后峰型达到对称,由此确定熊果酸检测的流动相。木犀草素参照邸多隆的方法[9]即可达到比较好的分离效果,并得到较好的峰型。

试验结果表明,湘西宏成制药不同基地所产的白花泡桐叶片中熊果酸和木犀草素的含量差别很大,其中4号基地白花泡桐叶片中熊果酸和木犀草素的含量均最高,与黄丽霞等报道的夏枯草中熊果酸含量[8]相比,其熊果酸含量更高,可以考虑增加该基地产量。另一方面,应对几个基地的白花泡桐品种、土壤成分进行研究对比,找出差异所在,以期提高其他基地原料的含量。

[1]赵留振.泡桐的临床外用[J].中医外治杂志,2003,(12):48.

[2]李晓强,武静莲,段文达,等.白花泡桐叶化学成分的研究[J].中药材,2008,31(6):850-852.

[3]张培芬,李 冲.白花泡桐花黄酮类化学成分研究[J].中国中药杂志,2008,33(22):2629-2633.

[4]陈保红,李寅超.泡桐花精油抗哮喘气道炎症的实验研究[J].中医研究,2007,20(10):16-18.

[5]Kassi E,Papoutsi Z,Pratsinis H,et al.Ursolic acid,a naturally occurring triterpenoid,demonstrates anticancer activity on human prostate cancer cells[J].Journal of Cancer Research and Clinical Oncology,2007,133(7):493-500.

[6]Kim J A,Kim D K,Kang O H,et al.Inhibitory effect of luteolin on TNF-α-induced IL-8 production in human colon epithelial cells[J].International Immunopharmacology,2005,5 (1):209-211.

[7]Chen J H,Xia Z H,Tan R X.High-performance liaquid chromatographic analysis of bioactive triterpenes in Perilla frutescens[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis,2003,32(6):1175-1179.

[8]黄丽霞,贾晓斌,陈 彦.HPLC法测定不同产地夏枯草中熊果酸的含量[J].中药分析与鉴定,2008,19(12):910-911.

[9]邸多隆,王 帅,马 潇,等.HPLC测定独一味中木犀草素的含量[J].中成药,2005,27(5):580-583.

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