大孔吸附树脂纯化油茶壳中多酚类化合物的研究

李嘉伟，邢 鹏，张迎娴，陆 英,2

（1. 湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙410128；2. 湖南农业大学国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙410128）

油茶属山茶科山茶属植物，为多年生乔木或灌木，在我国广泛分布于湖南、江西、广西等地区。近年来，湖南油茶业出现前所未有的发展趋势，油茶林面积达到126 万hm2，年产油茶12.1 万t，年产值达到72.66 亿元，居全国首位。油茶壳就是油茶果实的外壳，在传统的茶油制作过程中，大部分茶籽榨油之后，将油茶壳丢弃，造成珍贵资源的严重浪费。

植物多酚类化合物具有多种生理活性，植物多酚已广泛应用于医学、食品、制革和日用化工等相关领域，并发挥着不可替代的作用，具有广阔的开发应用前景。目前人们对油茶籽壳的开发利用主要集中在其茶皂素的研究[1]，对其中的多酚类化学成分报导较少[2]，笔者通过对油茶壳中多酚类化合物提取分离纯化工艺，获得高含量的油茶壳中多酚类化合物[3]，为进一步开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 FZ-102 微型植物粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司）；UV-2100 型紫外分光光度计（北京莱伯泰科仪器有限公司）；SK3300LH 超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司）；HY-4 调速振荡仪（江苏金坛中大仪器厂）；RE-52AA 旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂）。

1.1.2 材料与试剂 材料：油茶壳（怀化市洪源农林开发有限公司，干燥品）；试剂：没食子酸标准品（中国药品生物制品检定所，纯度98%）、钨酸钠、钼酸钠、Na2CO3溶液、溴水、磷酸、盐酸、硫酸锂。

1.2 油茶壳中多酚含量的检测方法

1.2.1 标准曲线的绘制 准确称取110.0 mg 含水9.2%的没食子酸，溶解并用蒸馏水定容至100 mL，此溶液没食子酸质量浓度为1 mg/mL。

分别称取1 mg/mL 的没食子酸标准储备液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、7.0、9.0、11.0 mL 至100 mL 容量瓶中，定容，溶液质量浓度为0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.07、0.09、0.11 mg/mL。

分别吸取以上各浓度的没食子酸标准使用液各1.0 mL，分别加5.0 mL 水、1.0 mL 钨酸钠-钼酸钠混合溶液和3.0 mL（75g/L）碳酸钠溶液，混匀，显色，室温下放置2 h，以标准曲线的“0”管为空白，在765 nm 波长下测定标准溶液的吸光度，以没食子酸质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.2 样品含量的检测 取1 克油茶壳样品，按料液比1:200 提取3 次。合并提取液，取1 mL，分别加5.0 mL水、1.0 mL 钨酸钠-钼酸钠混合溶液和3.0 mL（75g/L）碳酸钠溶液，混匀，显色，放置2 h，以标准曲线的“0”管为空白，在765 nm 波长下测定标准溶液的吸光度，根据标准曲线计算油茶壳样品中多酚的含量。

1.3 油茶壳多酚的提取工艺参数

1.3.1 工艺参数的确定 根据工业化生产的常规提取方法，提取次数通常为2 次，主要影响多酚提取率的其他4个因素分别为温度、时间、料液比和乙醇浓度。因此分别设温度（A）、时间（B）、料液比（C）、乙醇浓度（D）这4个因素，每个因素设3个水平（见表1），根据正交实验，确定提取油茶壳中多酚含量的最佳工艺。

表1 油茶壳多酚提取因素与水平设计表

1.4 大孔吸附树脂纯化工艺的研究

1.4.1 吸附树脂的预处理和再生 树脂的预处理：大孔吸附树脂先用95%乙醇充分浸泡24 h，湿法装柱，继续用95%乙醇在柱上流动洗脱，不时检查流出液直至流出液与蒸馏水混合（体积比为1∶5）不呈白色混浊为止，然后用蒸馏水洗涤至无醇味，备用。

树脂再生：用5%的柠檬酸溶液洗涤树脂，至流出液呈无色，再用3%的NaOH 溶液洗涤树脂，至流出液无色，最后用蒸馏水洗至中性，即可进行下一周期的使用。1.4.2 树脂的筛选 将预处理好的6种大孔吸附树脂（ADS-21、AB-8、NKA-2、NKA-9、D-101、聚酰胺）去表面水后，各精密量取1.0g，放置于具塞磨口锥形瓶中，分别加入100 mL 溶度一定的油茶壳多酚原料液，在摇床中振荡24 h，过滤，测定滤液中多酚浓度。吸附饱和的树脂再各用100 mL 70%乙醇解吸24 h，待解吸完全后，测定解吸液中多酚浓度，按下列计算公式分别计算树脂的吸附量和解吸率（树脂吸附量以单位质量湿树脂吸附的多酚量表示）。

根据公式计算获得各种树脂的吸附量和解吸率，通过比较，确定分离油茶壳多酚的最佳树脂类型。

1.4.3 树脂静态吸附动力学 将提取原液经旋转蒸发至无醇味，制得水溶液。取50 mL 待测水溶液，加入到1g 预处理好的最佳树脂中，在摇床中震荡吸附，于不同的时间测定溶液中多酚浓度。计算不同时间的吸附量，绘制吸附量-时间变化曲线。

1.4.4 大孔吸附树脂上样条件的选择 （1）pH 值对吸附量的影响：将提取原液经旋转蒸发至无醇味，得到多酚水溶液，测定其溶度及pH 值。取6 份各50 mL，用6 mol/L 盐酸分别调节pH 值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，7.0，然后加入到一系列1.0 g 已去表面水的最佳树脂中，在摇床中震荡吸附24 h，测定吸附后溶液中多酚含量，并计算出树脂的吸附量，根据树脂吸附量的大小综合考虑选择最佳pH。（2）料液浓度对吸附量的影响：取待测水溶液分成5 份，每份100 mL，分别加蒸馏水稀释至100、150、200、250、300 mL 将料液稀释，同时将pH 调到最佳，用50 mL 的最佳树脂以最佳流速进行动态实验，检测流出液中的多酚含量，计算树脂对多酚的吸附量，根据吸附量的大小综合考虑选择最佳料液浓度。（3）上柱流速对吸附的影响：取最佳多酚浓度的原料液5 份，同时将pH 调节至最佳，每份100 mL，分别按2、3、4、5、6 BV/h 的流速通过装柱体积为50 mL 的树脂柱，检测流出液中的多酚含量，计算树脂的吸附量，根据树脂吸附量的大小综合考虑选择最佳上柱流速。（4）泄漏曲线确定上样体积：按上述所确定的吸附条件，取最佳pH 值，最佳质量浓度的油茶壳稀释液以最佳的流速通过装柱体积为50 mL 的最佳树脂柱，分步收集流出液，对流出液进行检测，测定每份流出液的吸光度值，计算树脂对多酚的吸附量，绘制泄漏曲线，确定最佳上柱体积。

1.4.5 解吸剂的选择 分别取250 ml 最佳多酚含量的原料液以最佳的流速通过装柱体积为50 mL 的树脂柱5 份，吸附完全后，先用100 mL 的去离子水，再用300 mL不同浓度（40%、50%、60%、70%、80%）的乙醇溶液分别洗脱，收集不同乙醇浓度的洗脱液，检测5 份洗脱液中多酚含量，计算各种洗脱剂的洗脱率，选择最佳解吸剂。1.4.6 洗脱流速的确定 取5 份各250 mL 最佳多酚浓度的原料液（pH 值最佳），以最佳的流速通过50 mL 的树脂柱，吸附后，先用100 mL 的去离子水洗至流出液无色，再用200 mL 的80%乙醇溶液分别以2、3、4、5、6 BV/h 的流速进行洗脱，测定洗脱液中多酚含量，计算不同流速下的洗脱率，根据洗脱率的大小选择最佳洗脱流速。

1.4.7 洗脱曲线确定洗脱体积 按上述所确定的吸附、洗脱条件，取油茶壳稀释液250 mL（最佳多酚浓度，最佳pH 值）通过50 mL 树脂柱进行吸附。吸附后用水洗至流出液无色，再用80%乙醇洗脱，50 mL 为一流分收集洗脱液，测定各洗脱液中的多酚含量，制作洗脱曲线，确定最佳洗脱体积。

1.4.8 工艺扩大及样品纯度的检测 按上述确定的工艺条件工艺扩大，进行2 次重复试验，洗脱液浓缩后冷冻干燥，得到棕色产品，取适量样品用蒸馏水溶解，按2.2 中方法检测样品中多酚含量，测定样品纯度及提取率。公式如下所示：

2 结果与讨论

2.1 没食子酸多酚检测的标准曲线

根据2.2.5 中的方法测得各组对照品的吸光度值，以其为纵坐标，以对照品的质量为横坐标，绘制标准曲线，如图1，得线性回归方程y=0.006 8 x－0.069 5，R2=0.996。结果表明所测吸光度值在0.05～0.50 时，其没食子酸含量与吸光度值呈良好的线性关系。

图1 没食子酸标准曲线

2.2 提取工艺正交实验结果

2.2.1 实验结果 正交实验结果（表2）表明，影响提取油茶壳中多酚的主要因素依次为溶剂浓度（D）>提取温度（A）>提取时间（B）>料液比（C），以上4个因素均没有达到显著的要求，因此最佳组合为：A3B3C3D1。但是B2 和C2 的结果与B3 和C3 的结果相差不大，出于工业化考虑，提取的时间短，料液比低能够有效地降低生产成本，因此选用较佳工艺条件为A3B2C2D1。

表2 油茶壳中多酚正交实验结果及分析

即较佳条件：提取温度为90℃，提取时间为60 min，提取料液比为1∶15，乙醇浓度为40%。

2.2.2 样品含量的检测 根据油茶壳中多酚含量的检测方法，测得油茶壳中多酚含量为12.05%。

2.3 大孔吸附树脂纯化工艺

2.3.1 树脂的筛选 实验选用的6种不同的树脂都被广泛应用于不同植物多酚的分离纯化。对油茶壳多酚的吸附及解吸结果见表3。分析表3 中的数据，吸附量最大的是AB-8，达到了63.25 mg/g，其次是ADS-21 的吸附量有51.08 mg/g，但是解吸率最大的是ADS-21，解吸率是56.36%，AB-8 次之，解吸率有49.79%。虽然综合能力比较平均，但是出于经济考虑，AB-8 的价格比ADS-21低廉，因此后续工艺最佳树脂选定为AB-8。

表3 6种大孔吸附树脂的吸附量与解吸率

2.3.2 静态吸附动力学分析 由图2 可知，树脂对油茶壳多酚的吸附量，2～6 h 之间呈现先上升后下降的趋势，24 h 吸附量达到较高水平。但由于工业化生产中，树脂的吸附时间24 h 不符合生产效率，因此在合理的时间范围内，应选择吸附时间为4 h 较为合适。

图2 静态吸附动力学曲线

2.3.3 大孔吸附树脂上样条件的选择

（1）原料液pH 值对吸附量的影响。原料液不同pH 值对树脂吸附量的影响见图3。油茶壳原料液的pH值测得为3.7。从图3 中可看出，当原料液pH 值在3-4时，树脂的吸附量比较大。

图3 料液pH 值对吸附量的影响

天然多酚类多有酚羟基取代，故显酸性，根据大孔吸附树脂吸附原理，吸附过程中吸附介质以分子状态被吸附，因此要达到较好的效果必须使吸附质保持分子状态。一般情况下，酸性化合物在适当酸性溶液中充分吸附，但是酸度过大可能导致化合物结构变化，酸性不宜太强，而料液在pH 值为3.7（即本身pH 值）时的吸附量也比较大，因此，原料液在上柱前应保持pH 值在3.7 左右。

（2）料液浓度对吸附量的影响。不同多酚浓度的料液对吸附量的影响见图4。不同初始浓度的上样液，树脂的泄露曲线不同，树脂吸附量也不相同，浓缩后的原料液浓度测定为9.45 mg/mL，根据稀释比例设定梯度，各取5 份100 mL 原料溶液，由图3 可以看出，随着料液浓度的减少，树脂的吸附量增多，在稀释到250 mL（浓度为3.78 mg/mL）及300 mL（浓度为3.15 mg/mL）左右时吸附量差不多，效果较好，但出于工业化的考虑，浓度高能降低稀释成本，因此，选择最佳上样浓度为3.78 mg/mL。

图4 料液浓度对吸附量的影响

（3）上柱流速对吸附量的影响。上柱流速对吸附量的影响见图5。上柱流速过快，多酚类化合物没有被树脂充分吸附，影响吸附量，上柱流速太慢，多酚类物质可以充分吸收，但在工业化生产中则会影响生产效率，故应选择合适的上柱流速。从图5 可看出，随着上柱流速的增大，吸附率逐渐降低，故选择较低流速有利于吸附率的增大，但如果流速太慢则会影响工作效率，综合考虑树脂的吸附性能及工作效率，确定吸附流速以3 BV/h为宜，3BV 时，树脂的吸附率有95.82%。

（4）上样体积的确定。泄漏曲线见图6，由图6 可以看出50 mL AB-8 树脂处理700 mL（14BV）的原料液在上样液为8 BV 时漏泄量较少，漏泄液中浓度约为上样液浓度的1/10（泄漏液浓度为0.31 mg/ml），此时树脂对油茶壳多酚的吸附量27.76 mg/mL，因此，选择上样体积为8BV。

图5 上柱流速对吸附量的影响

图6 树脂的泄漏曲线

2.3.4 洗脱条件的确定

（1）洗脱溶剂的确定。不同浓度的乙醇对多酚的洗脱效果见图7。从图7 可以看出，洗脱液量达到6 BV 的时候，80%的乙醇基本能把油茶壳多酚从树脂上洗下来，洗脱量达到了91.42%。由于多酚含有的酚羟基比较多，对树脂的吸附能力较大，因此要选择较高浓度的乙醇进行洗脱为宜，但在工业化生产中，高浓度乙醇洗脱的成本较大，很难实现，因此本工艺选用80%的乙醇作为洗脱剂是较为合理的。

图7 不同乙醇浓度对洗脱效果的影响

（2）洗脱流速的确定。不同流速对洗脱率的结果见图8。从图8 中可知，2 BV 和3 BV 的洗脱率都达到了95 以上，用相同体积的洗脱剂洗脱，流速越慢，洗脱率越高，但流速过慢，耗时间长，不经济也不利于工业化生产。故综合考虑，洗脱流速选择3 BV/h 为宜。

（3）洗脱曲线的确定。洗脱曲线见图9。从图9 可以看出，当洗脱液体积达到300 ml 左右，即6 倍量树脂体积时，基本上能把吸附的多酚洗脱下来，洗脱率为92.71%。

图8 洗脱流速对洗脱率的影响

图9 树脂的洗脱曲线

（4）最佳工艺条件的确定及样品纯度检测。按上述所确定的最佳工艺条件，即料液浓度为3.78 mg/mL，料液pH 值在3.7，原料液以3 BV/h 的流速上柱吸附，再用6 倍树脂体积的80%乙醇以3 BV/h 的流速解吸，进行2次重复试验，洗脱液浓缩后冷冻干燥，得到棕色产品7.22g，取样品进行经检测，产品中多酚含量分别为62.5%、60.1%，平均多酚含量为61.3%。多酚回收率为77.64%。上柱原料液经冷冻干燥，同法测定多酚含量为12.05%，表明经AB-8 树脂纯化后多酚含量提高了5.08倍。样品得率为2.95%。

3 结论

通过上述实验对油茶壳中多酚类化合物分离纯化工艺的摸索，AB-8 树脂对油茶壳多酚具有良好的吸附性能。油茶壳样品中多酚含量为12.05%。产品中多酚含量达61.3%，多酚回收率为77.64%。该工艺获得产品纯度较高，操作简单，方便，成本低，适合工业化生产，为多酚的进一步开发利用奠定了基础。

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