防控烟草病毒病制剂的研发与应用

时间：2024-05-25

刘桔陈泽鹏林壁润杨明明沈会芳

摘要：采用浸泡消毒法、噴雾消毒法和熏蒸消毒法进行防控TMV、CMV的测试，采用抗原破坏性检测法来评价8种制剂的防控效果;采用枯斑测定法，进一步开发出对TMV、CMV的防控效果好的制剂。结果发现消毒剂GDCLO2（500 mg/L）对TMV、CMV的抗原破坏效果均为100%;复合酚（消毒灵）（2%）消毒液对CMV的抗原破坏效果为100%，对TMV的抗原破坏也有较强的效果;永洁康牌消毒粉Ⅱ（100 mg/L）、聚维酮碘溶液（400 mg/L）、2%戊二醛消毒液和三氯异氰尿酸钠粉（800 mg/L）对CMV有良好的抗原破坏效果。消毒剂GDCLO2可以完全杀灭TMV、CMV，其防控效果优于烟草苗棚常用的次氯酸钠溶液、复合型过氧乙酸消毒液、高锰酸钾和福尔马林。在国内外首次建立应用消毒剂GDCLO2培育无毒烟苗的操作规程，并在广东省所有烟区推广应用3年，累计推广应用面积达到34400 hm2，应用效果明显，全省烟区没有病毒病发生流行。本项目研发出来的GDCLO2消毒制剂，能够较好防控TMV、CMV。使用消毒剂GDCLO2培育无毒烟苗的操作规程已经在广东省所有烟区推广应用。

关键词：TMV CMV GDCLO2 防控制剂

中图分类号：S491 文献标识码：A

Development and Application of Preparation for Tobacco Virus Disease Control

LIU Ju1， CHEN Zepeng1， LIN Birun2， YANG Mingming3，

SHEN Huifang2，DENG Haibin1， YANG Qiyun2，

PU Xiaoming2， RUAN Xiaolei3*

（1Guangdong Tobacco Shaoguan Co.， Ltd.， Shaoguan，Guangdong 512000， China;

2 Plant Protection Research Institute ， Guangdong Academy of Agricultural Sciences /Guangdong Provincial Key Laboratory of New Technology for Plant Protection， Guangzhou，Guangdong 510640， China; 3 College of Plant Protection， South China Agricultural University / Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Signals and Crop Disease Control， Guangzhou， Guangdong 510642， China.）

Abstract： Eight preparations were used to control TMV and CMV by soaking， spray and fumigation disinfection method，and the control effects were evaluated by antigen detection method. The lesion test was used to further develop more effective drugs to control TMV and CMV. Results showed that GDCLO2 （500 mg/ L） had 100% antigen destructive effect on TMV and CMV; 2% compound phenol had 100% antigen destructive effect on CMV， and also had stronger effect on TMV. Yongjiekang disinfectant II （100 mg/ L）， polyvidone iodine solution （400 mg/ L）， 2% glutaraldehyde disinfectant and trichloroisocyanurate powder （800 mg/ L） had good antigen destructive effect on CMV. GDCLO2 could completely kill TMV and CMV， and its control effect was better than that of sodium hypochlorite， composite peroxyacetic acid， potassium permanganate and formalin. The technical process of using GDCLO2 to cultivate non-toxic tobacco seedlings was first established in the world， and has been popularized and applied in all tobacco areas in Guangdong Province for three years， with a cumulative application area of 34400 hm2 and obvious application effect， and no viral disease occurred during the promotion period.

Key words： TMV; CMV; GDCLO2; control preparation

烟草病毒病是我国烟草生产上的重要病害，每年造成重大经济损失 [1]。侵染烟草的病毒主要有烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY）[2] 等，其中TMV和CMV是烟草苗期最常见病毒。烟草无毒苗生产过程中，烟苗病毒的主要来源是带毒漂盘、剪叶工具及育苗人员的双手等，病毒可通过修剪、间苗等操作进行传播[3-6]。在苗期减少毒源、切断病毒传播途径是烟草病毒病综合防控措施中最重要的一环[5]。具体做法是：在育苗前期对育苗池和育苗盘，整个育苗过程中对剪叶机、操作人员自身乃至育苗棚内、外空间进行高效消毒[4]。采用绿色高效的制剂在育苗过程中的各个相关环节进行有效消杀是减少苗期病毒感染的重要保障。

生产中烟草育苗棚常用0.1%高锰酸钾、10%漂白粉或者2%福尔马林等制剂杀灭TMV和CMV[2]。刘勇研究表明质量分数30%有效氯漂白粉15～30 mg/L或高锰酸钾20～30 mg/L进行消毒，对TMV的抑制率高于80%[7]，可见传统制剂对病毒的杀灭活性不理想。刘勇等也评价了常用剪叶机制剂，表明30%有效氯漂白粉10倍液、98%磷酸三钠·12H2O 的10倍液、7%有效氯次氯酸钠150倍液、美国制剂125倍液和75%酒精，在3 min内抑制率可达100%，但除0.6%菌毒净较安全外，供试制剂在标签（常用）浓度下接触烟草叶片，产生较严重药害，产生的症状主要有褪绿斑点、坏死斑点或畸形[8]，与制剂种类有关，可见传统制剂在使用中存在一些问题，学者一直致力新型制剂的筛选和评价工作。尹利方等报道二氧化氯、育宝、毒消三种制剂消毒带毒剪刀后，防效依次为93.87%、67.03%、27.32%，3种制剂存在显著的防效差异，其中用16%二氧化氯200～600倍液浸泡污染了TMV的剪刀，均能有效控制TMV的传播;其中16%绿先锋牌二氧化氯800倍液浸泡消毒10 s即可有效防止TMV的传播，相对防效可达98%以上[9]。曹毅等用兆冠50 倍处理20 min、锦钰50 倍处理5 min和金百万20 倍处理20 min 可完全钝化病叶汁液中的病毒，常用浓度下金百万基本不产生药害;锦钰和兆冠易产生药害，症状主要表现为退绿斑点、坏死和叶片畸形[10]。吴德喜等用16%二氧化氯200～600倍液浸泡污染了TMV的剪刀，均能有效控制TMV的传播;其中16%绿先锋牌二氧化氯800倍液浸泡消毒10 s即可有效防止TMV的传播，相对防效可达98%以上[11]。另外，烤烟育苗生产中实际情况复杂多变，操作过程中缺乏规范的应用技术，防控效果并不理想。目前检测病毒是否被制剂灭活的主要方法有：细胞侵染活性检测、抗原破坏性检测 [7]等。本研究采用8种制剂进行测试和开发，并将之与烟草苗棚常用制剂的消杀效果进行了比较，研发出对TMV、CMV防控效果最好的制剂，更好地服务烟草产业。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试制剂

八种供试制剂：永洁康牌消毒粉Ⅰ、永潔康牌消毒粉Ⅱ（购于连云港永荣生物科技有限公司）;聚维酮碘溶液（聚福安）、复合酚（消毒灵）（购于广东省前沿动物保健有限公司）;戊二醛消毒液、邻苯二甲醛消毒液（购于衡水康益医药科技发展有限公司）;三氯异氰尿酸钠粉（烟雾弹）（购于凤舞集团奥福斯贸易有限公司）;消毒剂GDCLO2（广东省农业科学院植物保护研究所研发）。

四种常用制剂：次氯酸钠溶液（科密欧牌，有效氯含量大于等于6.5%）、复合型过氧乙酸消毒液（三桥牌，有效含量为150～180 g/L）、0.1%的高锰酸钾、2%的福尔马林均购自广东省精科生物有限公司。所有中和剂均购自汕头化学试剂厂。制剂相应的中和剂见表1。

1.1.2 供试毒源及抗血清

供试病毒：TMV（普通株系）、CMV（普通株系）分别保存在普通烟草（Nicotiana tabacum）上，由华南农业大学植物病毒研究室提供。取1g 症状明显的叶片，加去离子水和 600 目金刚砂充分研磨并稀释，制成1g/50mL的病毒液。

TMV、CMV特异性抗血清和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG由华南农业大学植物病毒研究室提供。

1.1.3 枯斑寄主

心叶烟（Nicotiana glutinosa）、豇豆（Vigna sinensis）由华南农业大学植物病毒研究室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 八种制剂对TMV和CMV防控效果测定

采用抗原破坏性检测来评价消毒效果。选取永洁康牌消毒粉Ⅰ（100 mg/L）、永洁康牌消毒粉Ⅱ（100 mg/L）、聚维酮碘溶液（聚福安）（400 mg/L）、复合酚（消毒灵）（2%）、戊二醛消毒液（2%）、邻苯二甲醛消毒液（直接使用）、三氯异氰尿酸钠粉（强氯精）（800 mg/L）和消毒剂GDCLO2（500 mg/L）进行器具浸泡消毒实验（所有使用浓度均为产品推荐使用浓度）。

选取永洁康牌消毒粉Ⅰ（100 mg/L）、永洁康牌消毒粉Ⅱ（100 mg/L）、复合酚（消毒灵）（1%）、消毒剂GDCLO2（500 mg/L）做喷雾消毒实验测试。

选取三氯异氰尿酸钠粉（强氯精，100 mg/m3）做空间熏蒸消毒实验测试。

1.2.1.1 器具浸泡消毒实验

对供试的带毒育苗盘、器具采用浸泡法消毒，检测供试制剂对器具表面的消毒效果。漂浮育苗盘、器具的带毒处理：分别取漂浮育苗盘、剪刀、镊子浸没于病毒液中30 min。取出放到温箱烘干，得到带毒育苗盘和器具。

参照赵祖国[12]和戴青等 [13]的操作方法进行。将带毒育苗盘和器具分别放入不同消毒液里浸泡30 min，取出放入1 L 中和剂里中和10～20 min。取出器具，用灭菌水冲洗几遍。用棉签擦拭器具表面。然后，将之放入装有1 mL 包被缓冲液的离心管里，盖好盖子。震荡20 min。取200 μL震荡液，做酶联酶联免疫吸附测定（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测。每种制剂测试6个样品，每个样品重复3次，取平均值。以制剂与中和剂反应的中和产物作为阴性对照;以中和产物加毒源作为阳性对照;清水作为空白对照。

1.2.1.2 室内空间喷雾消毒实验

对密闭空间采用喷雾法消毒，检测供试制剂对带毒空气的消毒效果。参照孔利群等[14]的操作方法进行。在密闭空间里（房间面积：13 m2;体积：47 m3），用喷雾器喷洒毒液（喷液量：150～250 mL）。空间四个角放置打开盖子的空培养皿。静置30 min。用喷雾器喷洒相应浓度的消毒液。静置30 min。用喷雾器喷洒相应浓度的中和剂，用量同上。中和10 min。取出培養皿，用灭菌双蒸水冲洗几遍。用棉签擦拭器具表面。然后，将之放入装有1mL 包被缓冲液的离心管里，盖好盖子。阴性对照、阳性对照、清水对照同1.2.1.1。

1.2.1.3 室内熏蒸消毒实验

对密闭空间采用熏蒸法消毒，检测供试制剂对带毒空气的消毒效果。参照毛又玲等[15]的操作方法进行。在密闭空间里（房间面积：13 m2;体积：47 m3），用喷雾器喷洒毒液（喷液量：150～250 mL）。空间四个角放置打开盖子的空培养皿。静置30 min。按1 g/m3用量将熏蒸剂分放于3个小碗中，点火进行烟熏，完毕后密闭门窗10 h。喷洒中和剂作用10 min，终止反应。将培养皿用蘸有抗原包被液的棉签充分擦拭，放入抗原包被液中震荡15 min，用ELISA检测TMV和CMV抗原破坏程度。阳性对照：不接触熏蒸剂的带毒培养皿。阴性对照：以PBS代替制剂进行试验。阴性对照、阳性对照、清水对照同1.2.1.1。

1.2.1.4 间接ELISA检测

ELISA结果判断方法：用BIO-RAD酶标仪（美国）检测在450 nm波长下各样品的吸光度值（OD值）。以实验组OD （S）值与阴性对照OD （N）值的比值判断TMV和CMV抗原破坏性检测结果。当S/N≥2.1时，结果判为阳性，小于2.1判为阴性。

1.2.2 GDCLO2与苗棚常用制剂防控效果对比

取烟草苗棚常用4种制剂：次氯酸钠溶液（科密欧牌，有效氯含量大于等于6.5%）、复合型过氧乙酸消毒液（三桥牌，有效含量为150～180 g/L）、0.1%的高锰酸钾、2%的福尔马林和GDCLO2（500 mg/L），采用细胞侵染活性检测（枯斑测定）评价其对TMV、CMV、PVY的防控效果。其中消毒剂GDCLO2设三个浓度梯度：400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L。次氯酸钠设三个浓度梯度：0.5%、1.0%、2%。过氧乙酸设三个浓度梯度：0.5%、1.0%、2%。

分别取TMV、CMV、PVY的病毒液，用灭菌纱布过滤后取上清做接种液。将一定浓度的制剂稀释液与 TMV/CMV/PVY病毒液等量混合，室温分别处理 30 min 后分别摩擦接种枯斑寄主心叶烟、豇豆、苋色藜。接种前喷洒适量金刚砂于叶片表面。接种叶左半叶接种去离子水处理的 TMV/CMV/PVY 病毒液（对照），接种叶右半叶接种经制剂处理的 TMV/CMV/PVY 病毒液。每半片叶接种 200 μL。接种后清水喷雾冲洗叶面，重复 3 次。接种 5～7 d 后统计枯斑数（取6 个半叶的平均值），计算抑制率。

抑制率（%）=[1-（处理平均枯斑数/对照平均枯斑数）]×100。

1.2.3 采用RT-PCR方法对处理后烟苗进行病毒检测

2018年、2019年、2020年在韶关、梅州、清远烟区使用消毒剂GDCLO2，用于无毒苗生产过程中苗棚、育苗盆、各种器具的消毒。要求各产区所有烟棚在烟苗移栽前10 d前，在苗棚内随机取样10株，寄送项目组进行病毒检测，病毒检测采用RT-PCR方法进行。

感染病毒的烟草植物组织总RNA的抽提：根据Takara公司植物组织 RNA 抽提试剂盒提取。

引物的设计与合成：根据已报道的TMV Longlin-2（GENBANK：HE818434.1）、CMV strain CTL segment RNA1（GENBANK：EF213023.1）的基因序列，采用引物设计软件Vector NT1 explorer设计普通RT-PCR扩增引物，具体序列如表2，由宝生物工程大连有限公司合成。

一步法RT-PCR反应：以抽提的待测植物组织样品的总RNA为模板，采用上述设计引物进行一步法RT-PCR反应，反应体系如下：RNase free ddH2O 27.5 μL;2 × One Step Mix 25μL;One Step Enzyme Mix 2.5 μL;Forward Primer （10 μM） 2 μL;Reverse Primer （10 μM） 2 μL;模板RNA 1 μL;共50 μL。反应程序如下：逆转录50 ℃，30 min;预变性94 ℃，5 min;变性94 ℃，30 sec;延伸55 ℃，30 sec;退火72 ℃，30 sec;终止72 ℃，10 min;4 ℃。RT-PCR 反应结束后，每个样品取 5 L 扩增产物进行 1 %琼脂糖凝胶上电泳。在UVP 凝胶成像系统进行观察记录。

2 结果与分析

2.1 防控烟草病毒病高效制剂的研发

采用浸泡消毒法（8种制剂）、喷雾消毒法（4种制剂）和熏蒸消毒法（1种制剂）初步测试了供试8种制剂对TMV和CMV的杀灭效果。结果见表3。按照推荐浓度，8种制剂对实验室污染剪刀上的TMV和CMV处理30 min均有消毒效果。其中消毒剂GDCLO2（500 mg/L）对TMV、CMV的防控效果最优，两种方法均为100%;复合酚（消毒灵）（2%）两种方对CMV的抗原破坏率均为100%，喷雾法对TMV的抗原破坏率为80%;永洁康牌消毒粉Ⅱ（100 mg/L）、聚维酮碘溶液（400 mg/L）、2%戊二醛消毒液和三氯异氰尿酸钠粉（800 mg/L）对CMV的有较好的防控效果。永洁康牌消毒粉Ⅱ（100 mg/L）、邻苯二甲醛消毒液对TMV的防控效果较差。

2.2 GDCLO2与常用制剂防控效果对比

表4展示了4种烟草苗棚常用制剂和GDCLO2分别处理TMV、CMV，接种枯斑寄主7天后对叶片上的枯斑进行统计的结果。结果显示400～600 mg/mL的消毒剂GDCLO2可完全灭活TMV、CMV病毒。其对TMV、CMV病毒病的防控效果要优于供试的其他四种常用制劑。

试验结果表明：消毒剂GDCLO2在浓度为400～600 mg/mL范围内，可将两种病毒百分之百杀灭。而2%福尔马林和1.5%过氧乙酸只能完全灭活TMV，对CMV不能完全杀灭。2%次氯酸钠只能完全灭活CMV，对TMV不能完全杀灭。

2.3 消毒剂GDCLO2大面积推广应用效果

2018年开始，全省100%的烟草种植区推广应用消毒剂GDCLO2，累计推广面积达到34400 hm2。技术操作规程是采用消毒剂GDCLO 400～600 mg/mL浓度溶液，对烟苗培育大棚和周围环境进行喷雾，对烟苗培育盆进行浸泡，在烟苗剪叶当天用药液喷雾烟苗，完成整个流程后，在烟苗移栽前10 d，随机抽样采样，送样到实验室，进行病毒检测。

2018年、2019年和2020年所有育苗棚烟苗样本病毒检测结果见表5和图1。结果表明，2018年首次将消毒剂GDCLO2在烟草育苗过程中进行推广应用，在烟苗移栽前10 d，采样进行病毒检测，2018年梅州、韶关、清远烟区TMV阳性检出率分别为5.68%、1.15%和1.45%;梅州CMV阳性检出率为2.84%，其它烟区的阳性检出率为0。

2019年、2020年在三个烟区开展消毒剂GDCLO2使用技术培训，要求育苗人员严格按技术规程进行消毒。2019年烟苗TMV与CMV的检出率比2018年的检出率大幅度降低，梅州烟区在送检样本数从2018年的176包至2019年的704包，大幅度增加的前提下，其病毒检出率明显降低，TMV阳性样本率从2018年的5.68%，下降到2019年的0.99%;CMV从2018年的2.84%下降至2019年的0。到2020年，三个烟区所有育苗棚样本均无病毒检出，可见消毒剂GDCLO2对TMV、CMV病毒病的防控效果在生产上得到验证。

3 讨论

3.1 消毒剂GDCLO2是一种新型的防控烟草病毒病制剂

本研究首次将消毒剂GDCLO2应用于烟草病毒的防控工作，证明其有良好的TMV、CMV杀灭作用。GDCLO2制剂是本项目研发的制剂。其具有较强的稳定性，污染小，使用方便;价格低廉。该制剂有效成分为二氧化氯，冷淑珍等[16-18]研究发现二氧化氯粉剂熏蒸剂（力保安）对鸡沙门氏菌熏蒸处理有显著的杀菌效果，杀菌率可达99.995%。无论应用于兽类病毒还是植物病毒方面，都展现了显著的杀灭作用。因此，GDCLO2制剂是一种新型烟草病毒病防控制剂。

3.2 消毒剂GDCLO2是一种高效、广谱的烟草病毒病防控制剂

烟草苗期病毒病是烟草生产上的一大难题。使用高效、环保的防控制剂是解决这个难题的主要方法。在防控过程中，制剂的防控效果受到制剂种类、使用浓度及剂量、环境条件、施用方式等因素的影响[19]。有研究认为不同种类的制剂对不同病毒的杀灭效果也各有差别，对部分病毒的差异十分显著[20]。尤其是TMV在环境中稳定性强，难以完全杀灭[2]。

选取适合的制剂，合理的施用方式，对杀灭烟草苗时期常见的TMV和CMV至关重要。本研究研发的消毒剂GDCLO2与其他植物病毒的常用制剂相比，防控效果显著，杀毒范围广泛，一次使用，可以杀灭两种病毒;使用方便，既可以浸泡，也可以喷雾。

3.3 建立培育无毒烟苗的操作规程，并大面积推广应用

在国内外首次建立应用消毒剂GDCLO2培育无毒烟苗的操作规程，并在广东省所有烟区推广应用3年，累计推广应用面积达到34400 hm2，TMV阳性样本率从2018年的5.68%，下降到2019年的0.99%;CMV从2018年的2.84%下降至2019年的0，到2020年，三个烟区所有育苗棚样本均无病毒检出。田间调查结果表明，2018-2020年全省烟区没有病毒病发生流行。

4 结论

本文研发的消毒剂GDCLO2针对TMV、CMV是一种新型防控制剂。500 mg/L的消毒剂GDCLO2在30分钟内即可全部杀灭两种病毒，这种制剂可以直接喷雾在烟苗叶子上有效地防控TMV、CMV病毒病，还可以广泛推广应用于烟草苗棚、苗池、苗盘、器具的消毒工作中。在国内外首次建立应用消毒剂GDCLO2培育无毒烟苗的操作规程，并在广东省所有烟区推广应用3年，累计推广应用面积达到34400 hm2，应用效果明显，全省烟区没有病毒病发生流行。

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