免疫亲和柱净化-高效液相色谱快速测定玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇方法初探

沈 萍 蒋 晨 （江苏省宜兴市农林局 214205）汪小平 （吉安职业技术学院，江西省吉安市 343000）

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol, DON），又称呕吐毒素（Vomitoxin），属单端孢霉烯族化合物，主要由禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌等多种镰刀菌在阴凉、潮湿的环境下生长产生，在自然界中广泛存在。DON主要污染玉米、小麦、大麦等粮食作物及其制品[1]，其理化性质非常稳定，在储藏及加工过程中很难被破坏，且长期贮存毒性基本不变，更有较强的抗热性（在121 ℃高温下处理30 min，仅有少量被破坏）[2]。同时，DON可在人和动物体内蓄积，极易产生致畸性、神经毒性、胚胎毒性等，引起人和动物生长严重受阻、免疫机能减退、肌肉协调性降低及呕吐等症状，因此，国际癌症研究机构（IARC）已将DON列为3类致癌物[3-5]。

虽然DON的危害已被人们熟知，但不同粮食品种中DON的快速、准确检测仍是难点。目前，粮食中DON的检测方法主要有薄层色谱法（TLC）[6]、酶联免疫法（ELISA）[7,8]和高效液相色谱法（HPLC）[9-11]等。但TL C法操作繁琐、污染大，属于半定量测定；ELISA法虽操作简便、灵敏度较高，但特异性较差，容易出现假阳性；所以，HPLC法是目前最常用的DON检测方法，具有快速、准确等优点。在此背景下，笔者采用免疫亲和柱净化样品、HPLC法测定玉米中的DON，以便建立一种快速、准确测定玉米中DON含量的方法。

1 材料与方法

1.1 供试材料

玉米（市售），DON标准品（纯度≥99%，美国Sigma公司），高纯氮（四川乔源气体有限公司），DON免疫亲和柱（北京华安麦科生物技术有限公司）。

1.2 主要试剂和仪器

甲醇、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、聚乙二醇8000（均为分析纯，成都市科龙化工试剂厂），甲醇（色谱纯，美国Fisher公司）。

岛津高效液相色谱仪（LC-20）带荧光检测器（RF-10AXL，日本岛津公司），电子天平（BT124，北京赛多利斯仪器系统有限公司），移液枪（ZX17224 20～200μL、ZX11858 100～1 000μL，美国Thermo Electron公司），全水温摇瓶柜（HYG-A，江苏省太仓市实验设备厂），旋转蒸发仪（RE-52B，上海亚荣生化仪器厂），离心机（Centrifuge 5810R，德国Eppendof公司）。

1.3 DON样品的提取与净化

将玉米样品粉碎后，过40目筛，然后准确称取（25.00 g）样品，加5 mL聚乙二醇8000，再加100 mL蒸馏水，于200 转/min震荡提取20 min，过滤，取1 mL滤液于一次性注射器中，将滤液以1～2滴/s的速率通过DON免疫亲和柱，待滤液排干后，用10 mL PBS缓冲溶液洗涤2次，流速2～3滴/s，待液体再次排干后，上4 mL甲醇，用样品瓶接洗脱液，流速1～2滴/s，洗脱后液体用氮气吹至近干，加1 mL流动相混匀，于10 000 转/min离心5 min后，取上清液，供HPLC测定。

1.4 色谱条件

色谱柱为Agilent Eclipse XDB C18柱（150 mm×4.6 mm,5 μm），流动相为甲醇-水（2∶8, v/v），柱温为30 ℃，流速为0.8 mL/min，检测波长为220 nm，进样体积为10 μ L，检测时间为15 min。

1.5 DON标准工作液的配置

准确称取1 mg DON标准品，用10 mL色谱纯甲醇溶解，并用10 mL棕色容量瓶定容，将上述溶液作为标准储备液保存于-20 ℃冰箱。准确移取100μL标准储备液，氮气吹干，再分别用流动相配成标准系列浓度为0.1、0.2、0.5、1、2、4 mg/L的DON标准工作液。

1.6 样品中DON含量测定与计算

将DON标准工作液和样品溶液按上述色谱条件测定，得到DON标准曲线，通过外标法定量分析，计算出样品中DON含量。样品中DON含量计算公式为：Y=[M×(V1/V2)×(M1/M2）]，其中，Y为原料中DON含量，μg/kg；M为进样体积中DON含量,μg；V1为提取样品所用溶液体积，mL；V2为进样体积,μL；M1为原料质量，kg；M2为提取样品质量，g。

2 结果与分析

2.1 DON标准品与DON玉米样品色谱图

按1.4色谱条件，分别对标准品和玉米样品中的DON进行测定，色谱图见图1。结果表明，标准品中D O N保留时间为8.7 7 mi n，而根据G B/T 23503-2009中色谱分离条件，测试样品中DON保留时间为12.98 min，与之相比，本方法的试剂和检测时间可节约32.4%。

图1 标准品与玉米样品中DON的色谱图

2.2 标准曲线及回归方程

将配制好的DON标准系列工作液，按色谱条件进行分析，并将DON标准溶液中质量浓度（C）与峰面积（A）进行线性回归分析，得到线性回归方程Y=47.35X+2.31，R=0.9998。DON的浓度在0.1～4 mg/L时，质量浓度（C）与峰面积（A）呈良好的线性相关性。根据DON测定产生的3倍信噪比（S/N）计算出该方法的检出限为0.02 mg/kg，以10倍S/N得出该方法的定量下限为0.067 mg/kg，能满足国家对玉米中DON的限量要求（≤1 mg/kg）。

2.3 回收率与精密度

在25.00 g不含DON玉米样品中，分别加入低、中、高3个水平的DON标准品，按上述实验方法对样品进行处理与测定，并通过加标回收率实验，比较本研究方法与GB/T 23503-2009差异。结果表明，本方法具有很高的准确度，见表1。

表1 本方法与GB/T 23503-2009测定DON含量结果对比

通过加标回收率试验，对本试验方法进行了精密度和准确度测定，结果表明，DON的平均回收率均大于80.0%，RSD均小于6.0%，说明本试验方法精密度、准确度能满足分析要求。见表2。

表2 不同加标量的样品回收率及精密度

3 结 论

本研究建立了一种免疫亲和柱净化-HPLC法检测玉米中DON的分析方法，检出限为0.02 mg/kg，定量下限为0.067 mg/kg。同时，通过对玉米样品进行加标回收试验，得出该方法具有较高的回收率与精密度，回收率均大于80%、精密度均小于6.0%。此外，从样品的提取、净化到检测，整个过程耗时不足1 h，从实际玉米样品检测结果看，该方法简便易行、快速准确、灵敏度高、检测限低，适合于大批量样品检测，值得推广应用。

[1]王金勇,刘颖莉,关舒.2013年中国饲料和原料霉菌毒素检测报告[J].中国畜牧杂志, 2013(4):39-42.

[2]Karlovsky P.Biological detoxification of the mycotoxin deoxynivalenol and its use in genetically engineered crops and feed additives[J].Applied microbiology and biotechnology, 2011,91(3):491-504.

[3]Pestka J J. Deoxynivalenol: Toxicity, mechanisms and animal health risks[J].Animals Breeding and Feed,2008,137(3):283-298.

[4]朱孟丽.高效液相色谱法对谷物中呕吐毒素的测定[J].粮食与饲料工业,2005(8):42-43.

[5]张鹏,张艺兵,鲍蕾,等.出入境粮谷中呕吐毒素检测方法的研究[J].检验检疫科学刊,2003,13(2):8-10.

[6]Putnam M L, Binkerd K A.Comparison of a commercial ELISA Kit and TLC for detection of deoxynivalenol in wheat[J]. Plant disease, 1992,76(10):1078.

[7]Sinha R C,Savard M E,Lau R.Production of monoclonalantibodies for the specific detection of deoxynivalenol and 15-acetyldeoxynivalenol by ELISA[J].Journal of agricultural and food chemistry, 1995,43(6):1740-1744.

[8]杨丹妮,汪海峰.小麦中呕吐毒素的ELISA和HPLC法检测[J].安徽农业科学,2013,41(3):1269-1270.

[9]MacDonald S J, Chan D, Brereton P, et al.Determination of deoxynivalenol in cereals and cereal products by immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography: interlaboratory study[J].Journal of Aoac international,2005,88(4):1197-1204.

[10]王伟,刘安法,李明奇,等.免疫亲和柱净化-高效液相色谱法检测小麦中的脱氧雪腐镰刀菌烯醇[J].粮食与饲料工业,2013,12(1):60-61.

[11]毛丹,许勇,张道广,等.HPLC法测定粮谷中的呕吐毒素[J].中国卫生检验杂志,2007,17(12):2207-2208.