江西省鲫鱼造血器官坏死病病毒(CyHV-2)感染流行病学研究

田飞焱 欧阳敏 谢世红 王龙 徐节华 刘文珍 花麒 孟霞 银旭红 刘彬

(1. 江西省水产技术推广站，江西南昌 330046；2. 彭泽县水产局，江西九江，332700)

0 引言

鲫鱼作为江西省食用鱼的主要品种之一，2016年江西省鲫鱼养殖产量达21.21万吨，产量稳步持续增长。目前，江西省养殖的优良品种鲫鱼包括：彭泽鲫鱼、萍乡肉红鲫鱼、异育银鲫鱼等，它们不仅有良好的食用价值，有些还有很好的观赏价值。然而，近年来，在江苏等省一种新的严重危害养殖鲫鱼的鳃出血性疾病开始悄然发生与传播，该病的致死率最高可达90%～100%，给这些省造成了严重的渔业经济损失，后经证实该鳃出血性疾病的病原为鲤疱疹病毒Ⅱ型[(cyprinid herpesvirus 2， CyHV-2[1-3]，疾病名称确定为鲫鱼造血器官坏死病，也有称为金鱼造血器官坏死病(Goldfish Haematopoietic necrosis， GFHN)]、异育银鲫“鳃出血病”或金鱼疱疹病毒性造血器官坏死病。该病主要发生在春秋季节，受水温影响较大，15℃～25℃易发病，水温高于25℃发病率下降[4，5]。目前，CyHV-2在内陆池塘养殖的鲫中有呈明显的蔓延趋势，因此调查江西省养殖区域是否存在CyHV-2分布显得尤为紧迫。为了调查了解CyHV-2在江西省鲫鱼养殖区域的传入与分布情况，保障江西省鲫鱼养殖业的持续健康发展，本研究于2015～2017年应用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction， PCR)和实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR， qPCR)方法对全省范围内一些重要苗种场和养殖场的养殖鲫鱼进行CyHV-2监测，并比较了不同地区CyHV-2分离株的分子特征，旨在摸清本地区鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV-2)流行本底情况，提高疫病风险预警防控能力，避免发生区域性重大疫情。

1 材料与方法

1.1 采样

鲫鱼样品：2015～2017年组织全省县级水生动物防疫站在全省范围内抽检水产养殖(苗种)场，每个水产养殖(苗种)场每年只抽检一个批次样品，三年共抽检80批体表检查均无明显病症的样品[根据某一鱼类养殖群体(≥100000尾)假定病原2%感染率，确定每批采集样品数≥150尾]，并依据流行病学情况填写现场采样记录，由省水产技术推广站水生动物疫病监控中心进行鲫鱼造血器官坏死病原检测；部分临床疑似病例在鲫鱼造血器官坏死病发病高峰期间由省内渔民送检，由省水产技术推广站水生动物疫病监控中心进行病原检测。

1.2 样品处理

取鲫鱼体内脏(一般为肾、脾、肝)或鳃置于研磨器中，加入10倍体积的无菌PBS研磨，反复冻融2～3次，待匀浆后将全部匀浆液转移至无RNA酶的EP管中，10000离心2分，取100μL上清液于1.5mL EP管中。

1.3 DNA抽提

取已处理的样品100μL，按照天根生物科技有限公司的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)试剂盒或Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit说明书的方法提取总DNA，作为PCR扩增模板。

1.4 PCR检测

使用TaKaRa PCR Amplification Kit进行PCR检测，采用两对特异引物(如表1所示)分别扩增 CyHV-2 的DNA聚合酶基因和解旋酶基因中的片段。反应体系为：10×PCR Buffer(Mg2+) 5μl，dNTPs (含dCTP、dGTP、dATP、dTTP 各10 mmoL/L) 1μl，引物CyHVpol-F(或CyHV2Hel-F)(10μM) 1μl，引物CyHVpol-R(或CyHV2Hel-R)(10μM) 1μl，DNA 模板2.5μl，Taq酶(5U/μL，TaKaRa) 0.5μl，纯水补足至50μl。反应程序为：94℃ 5min；94℃ 1min，55℃(CyHV引物)或60℃(CyHV-2引物)1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸 10min，最后4℃保温。

表1 CyHV-2 普通PCR 2对引物序列

1.5 荧光PCR复检

对普通PCR扩增条带不明显的监测或病例样品采用荧光PCR进行进一步的扩增检测(如表2所示)。在PCR管中依次加入：2×预混合液(2×supermix)6.25μL、正向和反向引物各0.5μL、探针0.5μL、模板2.5μL、加水定容至12.5μL。瞬时离心，将反应管置于荧光PCR仪。反应程序为：95℃ 2分；95℃ 30秒、58℃ 45秒、72℃ 45秒，共40个循环；在每次循环72℃退火延伸时收集荧光，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。

表2 CyHV-2 荧光PCR引物和探针序列

1.6 序列分析

所有PCR电泳呈阳性的样品的PCR产物经基因测序后用DNAStar以及NCBI BLAST对测序结果进行核苷酸序列同源性分析，从GenBank中选取与阳性序列相似的参考毒株，用MEGA 7.0软件构建进化树。

2 结果与分析

2.1 PCR检测

利用CyHV/CyHV-2引物进行PCR扩增后，阳性对照会出现362 bp/366 bp的特异性条带，阴性对照和空白对照均没有该条带，待测样品扩增出362 bp/366 bp的条带，初步判定待测样品pol/Hel PCR阳性，未扩增出目的条带得判定为pol/Hel PCR阴性。同时满足以上两条的可判定为CyHV-2阳性(如图1所示)。

图1 CyHV-2 PCR扩增电泳图

2.2 荧光PCR检测

对PCR扩增条带不明显的监测样品，采用荧光PCR进行进一步的扩增检测，Ct值≤35且出现典型扩增曲线，判定为荧光PCR阳性(如图2所示)；对于35

图2 CyHV-2荧光PCR扩增图谱

2.3 监测结果

如表3所示，2015～2017年在江西9个地级市的22个区(县、市)的水产养殖(苗种)场采集并检测样品80批次，监测品种包括鲫和金鱼，共监测到CyHV-2阳性样品6个批次，总的阳性检出率为 7.5%。阳性样品来源的地级市包括江西省鲫主养区南昌市、鹰潭市、吉安市和观赏红鲫养殖区萍乡市。阳性样品分布区域较为分散，赣东、赣中、赣西、赣南均有阳性检出，在地理上是分散的，并不连接成片，相互间没有水源相通。

表3 2015～2017年江西地区水产养殖(苗种)场CyHV-2监测情况

2.4 流行特征

时间分布：2015～2017年在江西地区春季检测样品32个，阳性5个，阳性检出率15.6%；秋季检测样品48个，阳性1个，阳性检出率0.02%。统计分析与2检验表明春、秋两季的CyHV-2的阳性检出率没有差别(P>0.1)，即季节对CyHV-2的阳性检出率无显著性影响。

遗传进化树和同源性分析：所有PCR电泳呈阳性的样品的PCR产物经基因测序后与GenBank中的参考序列进行NCBI BLAST同源性比对，相似度均在99%以上，确定为CyHV-2阳性。基于2015～2017年CyHV-2监测数据，进行CyHV-2 DNA解旋酶基因部分序列同源性的系统进化分析，结果显示江西省监测的所有CyHV-2毒株与YC110907、SY-C1、JS2012、H.Fukuda等CyHV-2病毒株属同一分支，与KHV-I、KHV-U等CyHV-3病毒株的亲缘关系较近，而与CyHV-1的亲缘关系相对较远(如图3所示)。

图3 基于CyHV-2 DNA解旋酶基因部分序列同源性的系统进化分析

3 讨论

20世纪90年代，在日本西部养殖的金鱼发生疱疹病毒性造血器官坏死病大流行，死亡率几乎达到了100%，这是有关该病的首次报道[4]。随后，美国养殖的金鱼幼鱼也发生此病，并存在着广泛的病原分布，造成的死亡率通常高达80%以上[5，6]。观赏鱼的国际贸易很大程度上促进了该病的迅速传播[7]，在这之后其他国家或地区相继有该疾病暴发的报道[8-11]，2011年在匈牙利养殖的银鲫也发现了CyHV-2感染的病例[12]，在我国鲫造血器官坏死病在2012年之前还未见有爆发流行的文献报道[13]，2013年李莉娟等针对国内市场上流通的金鱼开展CyHV-2的流行病学调查，表明不同区域的金鱼携带CyHV-2的带毒率为13.89%，表明我国已有CyHV-2的分布[14]。最近几年随着该病原的传入给我国一些地区的鲫养殖业带来了较大的经济损失。

已有研究表明，CyHV-2存在垂直传播的特性[15]，潜伏感染也是疱疹病毒的主要特征之一[16]，因此，一旦亲鱼携带病毒，就能通过鱼卵传播给子代，导致病原进一步扩大传播，苗种是渔业持续健康发展的物质基础，健康优质的苗种需要从源头上切断疾病的传播。鉴于全国范围内苗种和观赏鱼的流通使该病原传入我省的风险极大，必须通过病原监测来掌握该病病原传入与分布情况来提高我省疫病风险预警防控能力，避免发生区域性重大疫情。目前，江西省养殖的良种鲫包括：彭泽鲫、萍乡肉红鲫、异育银鲫、湘云鲫等品种，其中彭泽鲫是江西省选育出的优良品种，是“鄱阳湖”注册商标的重要养殖对象，并已逐步形成了我省的彭泽鲫产业集群；萍乡肉红鲫更是当地的百年特产，不仅有良好的食用价值，而且还很有观赏价值。连续三年(2015～2017年)监测的数据显示，80批次样品检出的6例阳性样本，累积平均阳性检出率为7.5%，6批阳性样品分别来自3家省级原良种场和3家成鱼养殖场，省级原良种场阳性样本占总阳性样本的50%，说明我省鲫养殖业和观赏金鱼养殖业存在感染CyHV-2的风险，也无疑会给鲫造血器官坏死病在江西省进一步扩大流行范围埋下了隐患。在监测所覆盖的9个各地级市中，有4个地级市检出了阳性样本，包括江西省鲫主养区南昌市、鹰潭市、吉安市和观赏红鲫养殖区萍乡市。阳性样本分布区域较为分散，赣东、赣中、赣西、赣南均有阳性检出，说明在江西省鲫造血器官坏死病存在扩大流行区域的特征。鉴于当前鲫造血器官坏死病病原阳性检出率和分布尚未成扩散的趋势，因此需要在鲫苗种的主要产区应进行苗种检验检疫，杜绝从阳性养殖场输出携带病毒的苗种，从源头上切断病毒的扩散途径，防控CyHV-2的传播，筑牢产业生物安全屏障。