HPLC-ELSD法测定不同产地、剂型黄芪饮片中黄芪甲苷含量

马 宁，郝 娟，王景雪

（1.太原市食品药品检验所，山西太原030006；2.山西大学生命科学学院，山西太原030006）

中药材黄芪最早记载于《神农本草经》，又名北芪或黄耆[1]。《中国药典》（2015版）中规定：黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，气微，味微甜，嚼之微有豆腥味，具有补气升阳、固表止汗、利水消肿、生津养血、行滞通痹、脱毒排脓、敛疮生肌等功效[2]。黄芪含有许多化学成分，主要为黄酮类、皂苷、多糖类及氨基酸[3]。研究表明，黄芪中含量最多的是黄芪多糖、蛋白多糖，其总量占22%[4]。黄芪甲苷（Astragaloside IV，AS-IV）是黄芪中一种关键物质，是蒙古黄芪和膜荚黄芪中主要活性成分之一，是评价药材质量的重要指标[5-7]，具有抗肿瘤、抗高血压、消炎[8]、增强免疫力[9]、增强机体抗病能力[10]、改善心肺功能等作用[11]，同时黄芪甲苷在肌纤维化[12]、神经系统疾病[13]、糖尿病[14]、肾病[15]等中的作用也有研究报道。

本试验以黄芪甲苷为指标，通过对涉及9个不同产地的黄芪样品18份，以及甘肃定西产炙黄芪2份、黄芪配方颗粒2份、黄芪破壁饮片1份共计23份样品的黄芪甲苷含量进行测定比较，以确定最佳的黄芪产地，并对常见商品化黄芪的质量作出评价。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为从太原市药店采购以及网络渠道采购的黄芪样品（表1），样品经粉碎过（250±9.9）μm筛，备用；黄芪甲苷对照品，中国食品药品检定研究院，批号：110781-201717。

表1黄芪样品信息

1.2 试剂

正丁醇、甲醇、无水乙醇均为分析纯；一级纯化水、D101大孔吸附树脂、氨水；乙腈为色谱纯。

1.3 仪器

Waters e2695 Separations Module液相色谱仪、waters 2424 ELSD检测器（上海沃特世有限公司）；旋转蒸发仪（德国IKA）；梅特勒ME204型万分之一天平（上海梅特勒-托利多有限公司）；电热恒温水浴锅（北京科伟永兴仪器设备有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 色谱条件 高效液相色谱法采用waters C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），柱温30℃；以乙腈-水（体积比为32∶68）为流动相，流速1.0 mL/min，蒸发光散射检测器漂移管温度50℃；载气压力35 psi。

1.4.2 溶液制备

1.4.2.1 对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为0.5 mg/mL的溶液，即得。

1.4.2.2 供试液的制备 将样品粉碎，过（250±9.9）μm筛，精密称取粉末4 g，加入甲醇40 mL冷浸过夜，用索氏抽提法加热回流提取4 h，浓缩提取液至干，残渣用10 mL水溶解，再用水饱和正丁醇振摇提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次40 mL，弃去氨液，将正丁醇液水浴蒸发彻底，残留物用5 mL水溶解，将水溶液通过D101大孔吸附树脂（内径1.8 cm，柱高20 cm），并且先用50 mL水洗脱，弃去水溶液后，再用40% 乙醇30 mL洗脱，弃去洗脱液，继用70% 乙醇80 mL洗脱，收集洗脱液，蒸发彻底，用适量甲醇溶解残渣，并将甲醇溶液转移至5 mL容量瓶中，定容。

2 结果与分析

2.1 线性关系分析

分别精密吸取对照品溶液20、40μL，注入液相色谱仪，按照1.4.1方法进行测定，如图1所示。用外标两点法对数方程计算，即以黄芪甲苷对照品进样量的对数值（X）为横坐标、峰面积积分值的对数值（Y）为纵坐标，得到方程Y＝1.717 1X＋5.196 8（R2＝1）。

2.2 精密度试验

取样品HQ-1作为供试品，按照1.4.2.2方法制成供试品溶液，并在1.4.1色谱条件下重复进样，共计5次，计算峰面积。结果表明，5次进样峰面积RSD为0.41% ，说明仪器精密度良好。

2.3 重复性试验

取HQ-1样品，按照1.4.2.2方法重复称取5份，每份4 g，并制成供试品溶液，在1.4.1色谱条件下连续进样，测定峰面积。结果表明，5次进样峰面积RSD为1.03% （n＝5），小于3% ，说明样品重复性较好。

2.4 稳定性试验

取样品HQ-2按照1.4.2.2方法制成供试液后，在0、2、4、6、8、12、24 h分别进样，在1.4.1色谱条件下测定峰面积，测得RSD为0.47% ，表明样品在24 h内稳定性良好。

2.5 回收率试验

表2黄芪中黄芪甲苷含量的回收率结果

精密称取已知含量的样品2 g，根据样品中含有的黄芪甲苷的含量加入适量的对照品溶液，按照1.4.2.2制备供试液，在1.4.1色谱条件下进行测定，计算回收率。结果表明，平均回收率为98.38% ，RSD为0.97% （表2），说明黄芪中黄芪甲苷含量的回收率符合要求。

2.6 样品测定结果

将2.1中样品按照1.4.2.2制备方法制成供试液，并按照1.4.1方法进行液相色谱分析，得到结果运用2.1中方程计算，具体含量如表3所示。其中个别样品色谱分析如图2所示。

由表3可知，所有黄芪样品的色谱峰与黄芪甲苷对照品的色谱峰相对保留时间一致，但不同样品的峰面积有所差异，对应的黄芪甲苷含量也不同，在不同产地黄芪中，产自于甘肃定西的黄芪中黄芪甲苷含量最大，为0.075 2% ，而产自四川理塘县的黄芪中黄芪甲苷含量最低，为0.020 1% （图2）；黄芪破壁饮片中黄芪甲苷的含量要明显多于黄芪配方颗粒，前者约为后者的2倍。所有黄芪样品，除了四川理塘产黄芪外，黄芪甲苷含量均满足《中国药典》（2015版）中最低限量要求（标准规定：黄芪含黄芪甲苷含量不得少于0.040% ，炙黄芪不得少于0.030% ）。

表3黄芪甲苷测定结果 %

3 结论与讨论

由于近些年来人们的保健意识增强，黄芪用量逐渐增大，而且随着人们对生活品质要求的提高，消费者的注意力更多地集中于产品的品质，所以，对黄芪进行质量评价具有很重要的意义。虽然中药材黄芪的产地丰富，包括内蒙古、甘肃、黑龙江、山西等，但是不同产地的地质及气候条件使得黄芪质量也不同[16]，比如在青海、四川等地种植的黄芪较主产地甘肃、内蒙黄芪来说，其质量往往差异很大。

本研究选取9个不同产地的黄芪共18批，其中包括内蒙古、甘肃、山西等主产地，也包括四川、宁夏等非主产地黄芪；甘肃产炙黄芪2批，还有黄芪配方颗粒2批，破壁饮片1批，共计23批次，而且所有黄芪正品样品中除四川理塘黄芪外，黄芪甲苷含量均符合《中国药典》标准规定，说明市场上黄芪质量普遍较好。从黄芪甲苷含量来看，甘肃定西黄芪最高，山西浑源次之，河北、黑龙江再次，而一直以来较少报道的宁夏六盘山产黄芪中黄芪甲苷含量为0.054 1% ，超过广西玉林、四川理县、青海等地位列第5，含量最少的为四川理塘县黄芪，其次为内蒙古呼伦贝尔产黄芪（HQ-4）。

黄芪破壁饮片中黄芪甲苷含量在所有被测样品中最高，而来自于山西省中医研究所的黄芪配方颗粒中，黄芪甲苷的含量较低。虽然这2种黄芪均作为常见药品出售，而且均为颗粒剂，但是含量差异较大。经过查阅相关资料，黄芪破壁饮片采用超微气流粉碎技术对植物细胞进行破裂，使得固体物料被打成粒径小于10μm的微粉，然后制成颗粒，并未经过长时间的煎煮过程，这样就使得有效成分被充分的暴露出来，从而更容易被检测到。而中药配方颗粒则只是在传统的煎煮方式上进行了改良，对个别名贵的动物药或者以粉末入药的药材选择超微破壁方法，大部分中药配方颗粒的制作过程与传统的煎煮方式并无二异，使得物料在煎煮过程中有效成分损失。所以，其有效成分的含量与中药饮片相比有所降低[17]。

在不同产地的黄芪中，四川理塘县黄芪的黄芪甲苷含量最低，在与黄芪甲苷对照品相应的保留时间附近，只有一个微弱的峰，而在保留时间3.00～5.00 min处，有2个很明显的峰，说明在四川黄芪中这2种对应的物质要比其他产地的黄芪多，具体为何种物质有待进一步检测[18]。本试验中，甘肃产炙黄芪为《中国药典》（2015版）收录的经蜜炙法后所得黄芪，与生饮片相比，其黄芪甲苷的含量降低了13.4% ，通过查阅文献[19]可知，不同的炮制方式会对黄芪甲苷的含量产生不同的影响，可见通过炮制后会对黄芪甲苷的含量有所影响。