植物单倍体育种研究进展

卜华虎 ，任志强 ，2，王晓清 ，肖建红

植物单倍体育种研究进展

卜华虎1，任志强1，2，王晓清3，肖建红1

（1.山西省农业科学院现代农业研究中心，山西太原030031；2.农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，山西太原030031；3.山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031）

很多植物存在生殖周期长、基因杂合度高、自交不亲和，且育种周期长、难度大等问题。植物单倍体加倍能够使植株快速纯合、使隐性基因表达，并且在形成单倍体过程中能够产生新的性状，创新种质资源。利用单倍体进行作物育种，可以加快育种进程、节约时间和成本、提高育种效率，是现代作物育种中快速、有效的方法之一。总结了单倍体的获得、加倍技术、鉴定方法以及单倍体研究进展，可为植物遗传育种提供技术和理论依据。

单倍体；孤雌生殖；双单倍体

作物传统的育种方法主要是通过优良自交系选育、优势杂交育种等手段进行，主要依靠育种者的经验，存在工作繁琐、育种周期长、优良品种获得速度慢等问题，不利于规模化和商业化育种。通过单倍体诱导，经染色体加倍后能获得基因位点完全纯合的双单倍体系（DH系），有效地缩短育种周期。此外，在杂合二倍体中许多不表达的隐性基因能够在DH系中表达，有利于发现作物的优良表型，改良作物的优良性状，提高作物的育种效率[1]。对于自交不亲和的物种，雌雄异株种类以及自花授粉后近交衰退的物种，单倍体诱导是选育自交系的唯一途径[2]。单倍体和双单倍体的主要优点是基因位点的完整纯合，使得表型选择更明确，特别是质量性状筛选更容易和有效[3]。

自然界中高等植物多具有来自父母本的2套染色体，称为二倍体。植物在有性生殖过程中产生的配子体一般只含有一套染色体，因而配子体成为单倍体获得的重要来源。1922年BERGNER在野生曼陀罗（Datura innoxia）中发现了单倍体植株。自1964年利用曼陀罗花药离体培养获得单倍体胚胎以来，越来越多的作物利用单倍体诱导技术获得亲本材料，单倍体育种技术也获得了广泛的运用[4-5]。人们开始对单倍体的特性、培育方法和原理进行广泛的研究，并相继培育出多种植物的单倍体植株。

单倍体材料中仅含1套染色体，植物一般弱小且高度不育，无法直接应用，通过加倍同源染色体之间具有单一性，即可获得二倍体纯系，只需2个世代即可获得稳定二倍体纯系，即双单倍体（DH系），DH系可以用于杂交种组配，在植物育种中已经被广泛运用。截至2005年，全球有250多种作物物种是运用双单倍体育种的，其中，玉米、小麦等12个物种使用DH系培育了300多个强优势的商业杂交种[6]。

1 单倍体诱导技术

自然界能够自发形成单倍体，但频率极低，仅在0.002%～0.02%[7]，不能满足育种的需求，因而通过人工方法获取单倍体成为主要的手段。目前，获得单倍体的主要方法有2种：一种是孤雌生殖，包括辐射或化学诱导的孤雌生殖、远源花粉刺激的孤雌生殖和孤雌生殖诱导系诱导的孤雌生殖；另一种是植物单倍体组织离体培养，包括雄配子体（花粉、花药等单倍体组织）离体培养和未受精的雌核（未受精的子房和胚珠等单倍体组织）离体培养。

1.1 孤雌生殖

孤雌生殖（parthenogenesis）也称单性生殖，即卵细胞不经过受精发育形成正常的新个体。通过辐射或化学诱导、远源花粉刺激以及孤雌生殖诱导系等方法，精子不能使卵细胞受精，但能够刺激卵细胞分裂并发育成单倍体。

1.1.1 辐射或化学诱导的孤雌生殖 辐射诱导孤雌生殖是指将经辐射处理后的花粉授于正常的柱头上，辐射后的花粉失去受精能力，不能使卵细胞正常受精，但其表面结构没有改变，能刺激卵细胞分裂并发育形成单倍体胚胎，从而获得母系单倍体种子和植株，这一技术已经被广泛应用于植株的单倍体获得[8]。雷春等[9]2006年利用γ射线辐射黄瓜雄花后授粉并结合胚胎拯救方法，获得了48个单倍体胚，并获得黄瓜单倍体植株。许利彩等[10]2009年通过辐射西葫芦花粉后进行授粉，并选取不同发育阶段的胚进行离体培养，结果发现，植株基因型、胚发育阶段以及辐照剂量和辐照时间显著影响单倍体的产生和植株再生率；每分钟辐照剂量为80～100 Gy时获得点状胚和箭形胚等总胚量最多，点状胚和箭形胚离体培养容易发育形成单倍体苗；每分钟辐射剂量为45.19 Gy时杆状胚获得率最高，杆状胚离体培养植株再生率和植株成活率最高，分别达到83%和35%。

另外，研究表明，某些化学药剂能够刺激诱导植物进行孤雌生殖，如二甲基亚砜、激动素、秋水仙素、甲苯胺蓝以及动物激素等。KITANI等[11]利用油菜素内酯涂抹拟南芥、芥菜和紫露草3种植物去雄后的柱头，获得了拟南芥和芥菜的单倍体植株，而紫露草仅获得嵌合体。赵佐宇等[12]利用二甲基亚砜（MDSO）、秋水仙素（COL）和马来酰肼（MH）等处理玉米未授粉的雌穗花丝获得19个纯合二倍体。刘飞虎等[13]用激动素（KT）、甲基亚砜和秋水仙素混合液喷洒荨麻花序以诱导荨麻孤雌生殖，结果表明，激动素诱导单株结实播种后出苗和成苗率最高，分别达68.4%和52.6%。孙耀中等[14]用动物激素乙烯雌酚、炔诺酮、甲地孕酮等喷洒太谷核不育小麦和败育小麦麦穗，成功诱导了小麦孤雌生殖，其中，甲地孕酮诱导结实率最高，达1.34%。

1.1.2 远源花粉刺激的孤雌生殖 植物中存在远缘杂交不亲和现象，远源花粉很难使受体植株卵细胞受精形成二倍体胚，但某些花粉则却能够刺激卵细胞分裂并发育形成单倍体胚，并由此产生单倍体或经自然加倍形成双倍体；且远源花粉受精后会产生染色体消除现象，可能产生新的基因型[15]。目前，远源花粉刺激的孤雌生殖多见于麦类作物单倍体的获得。1967年WEISS等发现，人与小鼠的体细胞杂交过程中存在排斥人体染色体的现象，这种现象被称为染色体消失现象，其随后相继在多种植物的种间杂交中被发现。利用远缘杂交染色体消除法获得单倍体在小麦、大麦等作物中被发现并广泛应用的。研究发现，球茎大麦、玉米、薏苡、珍珠粟等作物的花粉与小麦进行杂交，杂种胚在发育过程中排斥外源染色体，经过胚胎拯救就可获得仅含小麦基因组的单倍体植株[16]。

自1984年ZENKTELER等首次利用玉米花粉与小麦远源杂交获得小麦单倍体以来，国内外对远缘杂交获得单倍体的机理研究报道较多，也有关于玉米花粉与化学药剂复合处理小黑麦等获得单倍体的报道[17]。LAURIE等[18]研究表明，玉米基因组对小麦的Kr基因位点不敏感，远源杂交杂后合子细胞核排斥玉米染色体，从而诱导形成小麦单倍体，而且成胚率较高。普通小麦通过与高粱[19]、珍珠粟[20]、类玉米（大刍草）[21]、鸭茅状摩擦禾[22]等杂交，成功诱导产生小麦单倍体。1975年BARELY[23]利用普通小麦与球茎大麦杂交成功获得了多个小麦单倍体。ZENKTELER[24]最早研究发现，普通小麦与玉米之间远源杂交能够形成单倍体。随后LAURIE[25]研究表明，用玉米花粉与小麦杂交后，在合子前3次分裂过程中，来自玉米的染色体会被完全消除，形成仅剩小麦染色体的单倍体胚。

利用烟草野生种非洲烟草（Nicotiana tabacum L.）与烤烟杂交，产生母本来源的单倍体[26]。此外，种内二倍体杂交产生单倍体主要发生在银胶菊、高粱、大蒜和紫花苜蓿中。种内不同倍性水平间杂交产生单倍体的有蕨麻、柑橘以及甜菜。种间杂交产生单倍体的有洋红色玉兰和橘红色玉兰，月见草，高粱，草莓，披碱草、菊苣、梨和甘蓝等。

1.1.3 孤雌生殖诱导系诱导孤雌生殖 孤雌生殖诱导系与受体植株杂交后具有较强的形成单倍体植株的能力，是目前诱导玉米形成单倍体的主要方法之一[16]。1950年，COE[27]发现了一个高频诱导单倍体的玉米材料，并对其进行改造选育出Stock6，单倍体诱导率达2.3%。国内外很多单位以Stock6为基础进行改良和选育，获得了多个新单倍体诱导系，选育出SW14、农大高诱系列、ZMs、吉高诱系列等多个诱导系。诱导系活体诱导单倍体操作简便、诱导效率高，诱导率高达8%～10%[28]。孤雌生殖诱导系诱导单倍体在玉米单倍体育种中得到应用，通过这种方法选育出多个优良自交系和品种，但在其他物种中未见报道。

1.2 雄配子体离体培养

植物在有性生殖过程中进行减数分裂产生单倍体小孢子，当小孢子正常发育途径受到阻碍时会抑制形成配子体，促进其进行有丝分裂，形成愈伤组织或胚状体，最终发育成单倍体的孢子体。因此，可以通过抑制小孢子正常发育，诱导形成单倍体植株[29]。自1964年GUHA等[30]首次报道通过离体培养曼陀罗花药获得单倍体植株以来，该方法已在多种作物上成功获得单倍体植株。雄配子体离体培养分为花粉培养和花药培养，其中，花粉培养又称为游离小孢子培养，是以单个花粉作为外植体进行离体培养的技术，花粉都为单倍体组织，因而，培育出的植株都为单倍体；花药培养则是将花粉发育至一定阶段的花药接种到人工培养基上进行离体培养，形成愈伤组织或胚，进而分化形成植株，花药除含有单倍体的花粉外，还含有二倍体的花药壁、绒毡组织等二倍体组织，因而，需要后续的筛选和鉴定[31]。花粉和花药培养受到基因型、生长发育阶段、预处理条件等的影响，在进行雄配子体离体培养时应进行前期的倍性筛选。

1982年，LICHER 首次以油菜（Brassica napus）小孢子为材料培养出单倍体[32]，之后国内外许多育种专家通过小孢子离体培养在多种植物中获得了单倍体植株，并且对影响小孢子培养的条件、产胚量、成苗率、单倍体加倍以及后代遗传稳定性等多种因素进行了广泛的研究，确定了最适培养条件。从20世纪70年代利用花药培养技术获得多种花粉单倍体以来，花药培养技术在遗传育种中的作用日益突显[31]，花粉单倍体加倍后的双单倍体在植物育种、突变、遗传作图、植物改良以及转基因运用等方面具有广阔的应用前景[33-34]。

胡道芬等[35]于1982年首次利用雄配子体离体培养技术选育出小麦品种京花1号，并推广应用。杭玲等[36]通过花药培养和选育培育出玉米杂交种桂三1号，1992年通过广西壮族自治区品种审定，成为我国首个利用雄配子体离体培养方法育成的玉米杂交种，推广面积超过5 300 hm2。

1.3 未受精的雌核离体培养

离体雌核离体培养又称大孢子发育技术，目前主要是通过离体培养未授粉子房或胚珠等单倍体组织获得单倍体植株，该方法也成功运用于多种植物单倍体植株的获取[37]。TULECKE[38]于1964年最先从裸子植物银杏（Ginkgo biloba）的未受精子房得到单倍体愈伤组织。1976年SAN[39]首次通过大麦未授粉子房培养得到单倍体植株。目前，已有多种植物成功通过组织培养未授粉的雌核产生单倍体，如洋葱、甜菜、黄瓜、南瓜、非洲菊、向日葵[40]等；草莓、黄瓜、西葫芦、南瓜、甜瓜等通过离体未受精子房培养获得单倍体植株；大麦、烟草、玉米、水稻、小麦等通过未受精子房培育出单倍体植株[41]。

黄国中等[42]利用16种不同的玉米材料，分别对其未授粉的雌穗进行离体直插或切段直插培养，成功获得植株并结实。陶自荣等[43]通过选取5个品种诱导马铃薯进行离体雌雄配子体培养，结果表明，其中2个品种获得了少量的单倍体再生植株，再对其进行茎切段培养，可以产生大量的单倍体试管苗和小薯。

2 单倍体的加倍

单倍体材料中仅含一套染色体，植物单倍体一般植株弱小且高度不育，不能直接用于遗传育种和生产运用，需经过加倍形成双单倍体才能在育种中运用。目前有自然加倍和人工加倍2种方法：自然是通过自发加倍，加倍率低；人工加倍主要是通过化学方法加倍，加倍率高。

2.1 自然加倍

在诱导单倍体过程中染色体会出现自发加倍的现象，目前许多植物中都发现存在一定比例的单倍体植株自发进行染色体数目加倍，这种比例受到外界环境和材料基因型等因素的影响。研究表明，不同基因型玉米存在0～21.4%的自然加倍率[44]；而不同基因型油菜则具有10%～40%的自然加倍率[45]；一些大麦品种的自然加倍率则高达87%[46]。影响单倍体自然加倍的因素主要来自于生长环境，包括温度、营养、湿度以及其他生物逆境等的影响[47]。染色体自然加倍是普遍存在的，但是加倍率较低，不利于大规模运用。

2.2 化学加倍

单倍体植株存在自然加倍，但加倍频率一般较低，不利于生产上广泛运用，因而，采取人工加倍染色体成为单倍体加倍的主要手段。诱导染色体加倍的传统而有效的方法是用秋水仙素处理，通过浸根、浸芽、浸泡分蘖节等方法进行加倍。秋水仙素（Colchicine，COL）是微管特异性药物，是诱导植物体细胞染色体加倍最有效的化学诱变剂之一，适宜浓度的秋水仙素能破坏或抑制纺锤丝的形成，使细胞复制时染色体不能分向两级，导致新生细胞的染色体加倍[48]。

人工加倍最早使用秋水仙素作为诱变剂，后来人们发现吲哚乙酸、萘啶乙烷、生长素等植物生长调节剂，芫荽脑、苯及其衍生物、磺胺剂、藜芦碱及其他植物碱、麻醉剂等次级代谢产物以及有机砷、有机汞等化学物质等也能诱导染色体加倍。近年来还有报道，萘嵌戊烷和一些除草剂类物质（如二苯基胺、磷酰胺、苯基酰胺、氟乐灵、氨磺乐灵、拿草特及一氧化氮等）也可使植物的染色体加倍[49]。

3 单倍体的筛选

雌雄配子体培养获得的植株多具有较高的倍数性水平，或者染色体丢失形成非整倍体；单倍体通过自然和人工加倍后，往往是单倍体、双单倍体、杂合体以及嵌合体的混合群体，因此，需要对植株进行鉴定，才能运用于后续育种。

鉴定单倍体植株和二倍体植株的方法很多，主要有植株形态学观察、细胞学观察和分子生物学鉴定，采用适合的鉴定方法是获得单倍体植株的有效前提。

3.1 形态学特征鉴定

单倍体和相应的双单倍体植株具有同一套基因组，因而表型相似，但由于单倍体仅含一组染色体，表现为细胞体积较小、植株的叶片面积、花茎以及种子等营养器官和繁殖器官较二倍体小，植株也较矮[50]。此外，单倍体植株开花一般较早，持续时间也较长，单倍体不能进行减数分裂，雌花不正常且败育彻底，花药多是皱瘪不易爆裂。这是一种直观简便的鉴定方法，但需要植物生长发育到某个特定的时期才能进行检测，对于生长周期较长的木本植物检测周期过长。

其次，气孔密度、大小及保卫细胞中叶绿体的数量与作物的倍性存在一定的相关性。植物的倍性与叶片单位面积气孔数量紧密相关，单倍体植物与相应的二倍体比较，单位叶面积气孔数量增多，气孔直径减小、叶绿体含量降低，测定气孔保卫细胞大小和长度成为一种简单、有效的早期鉴定单倍体的方法[51]，但是气孔的形态和数量受到植株生长状态的影响，会对鉴定结果有一定的影响。

3.2 细胞学观察

细胞中染色体的数目能够直接反映植株的倍性，检测染色体数量是鉴定植株倍性最准确、最有效的方法。其次，不同倍性植株的细胞核中DNA含量差异显著，可以通过检测细胞中的DNA含量来估计植株的倍性。目前，流式细胞仪能够通过快速检测细胞中DNA的相对荧光强度来分析DNA的含量，进而确定植株的倍性，该方法具有快速、高效、准确等特点，适合于多种植物的倍性鉴定，且能够鉴定出嵌合体，但是设备昂贵，不适于实验室使用。SARIO等[52]利用流式细胞仪测定西瓜细胞核内DNA的含量和细胞核大小，能够快速准确地确定细胞倍性来鉴定植株的倍性。

3.3 分子生物学鉴定

DNA中含有多种等位基因、SSR以及SNP等分子标记等位点，成为以DNA分子为基础的倍性检测的重要标记。利用分子生物学检测不仅可以将单倍体、二倍体植株以及双单倍体植株进行准确地区分，在基因型高度杂合材料倍性的鉴定上具有优势，而且仪器和设备简单，易于操作，成为目前应用最广泛的单倍体检测方法[31]。CHEN等[53]2001年通过RADP和ISSR以及RFLP联合标记，鉴定通过花粉培养出的单倍体亚麻植株。汤飞宇等[54]利用SSR标记并结合大田农业性状，对玉米178×黄C杂交种子房培养的再生植株后代进行分析，发现2株在随机检测的多个位点纯合，鉴定为自发加倍的双单倍体。

4 单倍体在植物育种中的作用

目前，单倍体在植物遗传育种中已经得到广泛应用，主要农作物、蔬菜、水果以及药用植物等都有单倍体育种报道。单倍体育种能够缩短育种年限、节约成本、提高育种效率以及扩展种质资源，因而成为作物遗传育种的重要手段。

目前，多种农作物都有单倍体育种的报道，玉米、水稻、小麦、油菜等都有育成的品种。通过单倍体技术选育的玉米品种有桂三号、遗单6号、科玉10号、秦单5号等，并已在生产上进行推广。陈新民等[55]利用小麦×玉米诱导单倍体技术选育出高产、节水、抗病小麦新品种中麦533。刘勇等[56]利用单倍体技术获得双抗TMV（烟草花叶病毒）和PVY（烟草马铃薯Y病毒）的烟草株系。水稻通过花药培养选育出了单丰1号、花育1号、花育2号、中花系列粳稻品种、合江21号、龙粳系列粳稻品种。国内利用花药培养技术培育出小麦京花系列、甘春16号、豫麦系列、花培系列、冀麦42、杨麦9号、陕农28号等品种，并在生产上大面积推广。大麦、小黑麦也有通过单倍体育种的报道。

其次，单倍体育种在蔬菜水果中也有运用，目前，西瓜、西葫芦、南瓜、苹果、桃、草莓、大蒜、黄瓜、辣椒、甜瓜、芥菜、洋葱、苦瓜、大白菜等多种水果和蔬菜都有单倍体育种的报道。另外，单倍体在药用植物育种中的运用也有报道。目前，我国利用花药培养已得到宁夏枸杞、人参、乌头、平贝母和三叶半夏等多种药用植物的新品种[57-58]。

5 展望

单倍体经过加倍后，基因型完全纯合，隐性基因也能够表达，纯合速度快，增加了品种表型，不需要传统育种过程中连续多代自交纯合，适合某些特定表型的纯合，适合自交不亲和植物物种的育种，也可以应用于快速繁殖、突变育种和转基因育种等方面。

单倍体对作物遗传育种具有重要的意义：通过单倍体的诱导和加倍可快速获得异花授粉作物的自交系和无性系，加快纯系的选育及亲本种子纯化；单倍体培养和加倍过程中会出现基因突变，能够创新种质资源，增加群体遗传多样性；诱变单倍体能够快速发现隐性基因突变，有利于突变体筛选和基因功能的研究。

随着科学研究的发展，多种作物都能依据各自特性，选取最适合的诱导方法和加倍条件，对单倍体诱导、再生以及加倍条件机理等方面的研究，有利于增加育种速度、提高育种效率，将单倍体诱导技术更好地运用于规模化和商业化育种中。

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Research Advances in Haploid Breeding of Plants

BUHuahu1，RENZhiqiang1，2，WANGXiaoqing3，XIAOJianhong1
（1.Research Center of Modern Agriculture，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；2.Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement on Loess Plateau，Ministry of Agriculture，Taiyuan 030031，China；3.Research Center of Biotechnology，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

Many plants have many problems such as long reproductive cycle,high gene heterozygosity,self-incompatibility,long breeding cycle and great difficulty.Doubled haploid plants enables homozygous fast,can make recessive genes expression,and in the process of formation haploid can produce new traits,innovate germplasm resources.Haploid technology using in breeding can greatly accelerate the breeding process,save time and costs,improve breeding efficiency,which is one of the effective ways of modern fast and efficient plant breeding method.This paper summarizes the haploid obtained methods,doubling technique,identification methods and research advancesin haploid breeding,which will provide technical and theoretical basisfor plant genetic breeding.

haploid;parthenogenesis;doublehaploid

S335.4

A

1002-2481（2017）12-2032-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.12.32

2017-07-09

山西省农业科学院种业发展专项（ymzy2016008）；山西省农业科学院生物育种工程项目（16yzgc125）

卜华虎（1986-），男，安徽滁州人，助理研究员，主要从事作物遗传育种及资源创新研究工作。任志强为通信作者。