一株野生毛头鬼伞的分离鉴定及其生物学特性研究

曹晋良，康 曼，韩建荣

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

一株野生毛头鬼伞的分离鉴定及其生物学特性研究

曹晋良，康 曼，韩建荣

（山西大学生命科学学院，山西太原030006）

对采自芦芽山的一株大型野生食用菌ZMM-3进行了分离鉴定，并对其生物学特性进行了研究。利用组织分离的方法获得该野生菌株，并且提取其基因组DNA，以其为模板扩增内转录间隔区（Internal transcribed space，ITS）片段并测序。根据ITS序列分析结果结合形态特征，将ZMM-3菌株鉴定为毛头鬼伞（Coprinus comatus）。通过对ZMM-3菌株生物学特性的研究发现，其最适生长温度为25℃，最适碳源为蔗糖，最适氮源为酵母粉，最适碳氮比为（10∶1）～（20∶1），最适pH值为7～8。采用棉籽壳、木屑、稻草、玉米芯、玉米秸秆等栽培料对该野生菌株进行了出菇栽培试验。结果表明，该菌株在稻草培养料上生长最快，在稻草和玉米秸秆上发满菌覆土即可出菇，其生物转化率分别为11.18%和22.28%，所以，玉米秸秆栽培料是ZMM-3菌株的最适栽培料。

毛头鬼伞；生物学特性；鉴定

毛头鬼伞（Coprinus comatus）又名鸡腿菇、鸡腿蘑等，是真菌门担子菌亚门层菌纲伞菌目鬼伞科鬼伞属的真菌[1]。众所周知，蘑菇中含有大量的生物活性物质，比如维生素及维生素前体、多糖、多酚类化合物，这些化合物对动脉粥样硬化、糖尿病、癌症等疾病的预防有明显效果[2]。其中，鸡腿菇是近年来我国发展较快的一种珍稀食用菌。2003年，我国鸡腿菇年产量已达到17.7万t，已成为我国的第6大食用菌品种[3]。鸡腿菇不仅营养丰富、味道鲜美，而且还有降血糖、降血脂、增进食欲、提高免疫力的功效[4]。因此，鸡腿菇是广大食客们以及亚健康人群作为保健食品的良好选择之一。虽然鸡腿菇已经商业化栽培，但是分离野生菌种并且研究其生理特性，充分保护和利用野生食用菌资源依然是今后农业发展的一大热门产业[5]。

本试验对芦芽山野生毛头鬼伞进行了菌种分离以及生物学特性的研究，旨在为其栽培驯化提供理论指导。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 采集自山西省芦芽山自然保护区，经组织分离获得编号为ZMM-3的菌株，保存于山西大学生命科学学院微生物学实验室。

1.1.2 主要试剂 β-巯基乙醇、蛋白酶-K（10 mg/ mL）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

真菌提取试剂盒、rDNA ITS分析所用的ITS4和ITS5通用引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培养基配制 加富PDA培养基按照吕作舟[6]的方法配制，基础培养基按照李蝶等[7]的方法配制，麦粒种培养基按照康曼等[8]的方法配制。

栽培料配方：（1）木屑85%+麦麸12%＋蔗糖1%＋石膏1%＋KH2PO41%；（2）棉籽壳85%＋麦麸12%＋蔗糖1%＋石膏1%＋KH2PO41%；（3）玉米秆85%＋麦麸12%＋蔗糖1%＋石膏1%＋KH2PO41%；（4）玉米芯85%＋麦麸12%＋蔗糖1%＋石膏1%＋KH2PO41%；（5）稻草85%＋麦麸12%＋蔗糖1%＋石膏1%＋KH2PO41%。

1.2.2 ZMM-3菌株同步菌丝的制备 将ZMM-3菌丝体接于已经配制好的PDA平板培养基上，待菌丝体长满整个平板之后，用直径为7 mm的打孔器制作大小相同的菌饼，用接种铲将菌饼接到供试培养基上，观察记录菌落的形态以及菌丝的生长状况[8]。

1.2.3 形态学观察 将菌饼接于PDA培养基上，待菌丝长满平板之后，观察和记录菌丝体形态、菌落形态，用MOTICB显微镜观察并拍照。

1.2.4 扩增ITS序列[9-11]将ZMM-3菌株接于PDA培养基上，置于25℃培养箱暗室培养，待菌丝长满平板之后，收集菌丝体烘干，用真菌提取试剂盒提取DNA。PCR扩增引物：ITS4：5′-TCCTCCGCT TATTGATATGC-3′；ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCG TAACAAGG-3′，扩增片段大小为600～750 bp。引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司。采用张倢等[9]的PCR反应体系。PCR条件：95℃预变性5 min；95℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸105 s；72℃延伸10 min，共35个循环。扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析。PCR产物的纯化和DNA测序由上海生物工程股份有限公司完成。将测序结果提交至GenBank，进行BLAST比对，同时获得菌株的登录号为：KX015766。

1.2.5 扩增产物检测 取5 μL扩增产物点入1.0%的琼脂糖凝胶中，在120 V电压下电泳35 min，以2 000 bp DNALadder作为分子量标准，用1 μg/mL Gelview染色后置于UVP-GDS800自动成像仪中观察拍照，剩余的产物在-20℃冰箱中保存备用。

1.2.6 ZMM-3菌株最适母种培养基的筛选 为了获得ZMM-3菌株的最适母种培养基，本研究通过观察菌丝体在9种不同培养基上的生长情况，从而对母种培养基进行筛选。9种培养基的配方分别如下。

1.2.6.1 合成培养基 葡萄糖2.5 g，KH2PO40.125 g，氯化钠0.05 g，酵母汁25 mL，MgSO40.05 g，CaCO30.5 g，琼脂5 g，H2O250 mL。

1.2.6.2 玉米粉蔗糖培养基 玉米粉10 g，琼脂5 g，蔗糖2.5 g，蒸馏水250 mL。

1.2.6.3 葡萄糖麦芽膏酵母膏培养基 葡萄糖2.5g，麦芽浸粉2.5 g，酵母膏1.0 g，琼脂5 g，蒸馏水250 mL。

1.2.6.4 马粪培养基 马粪37.5 g，蔗糖12.5 g，琼脂5 g，蒸馏水250 mL。

1.2.6.5 麸皮培养基 麸皮25 g，琼脂5 g，葡萄糖5 g，蛋白胨0.5 g，KH2PO40.375 g，MgSO40.375 g。

1.2.6.6 PDA马铃薯50 g，葡萄糖5 g，琼脂5 g，H2O250 mL。

1.2.6.7 马铃薯合成培养基 马铃薯50g，葡萄糖5g，KH2PO40.75 g，MgSO40.375 g，维生素B12.5 mg，琼脂5 g，H2O250 mL，pH值5.8～6.2。

1.2.6.8 麦粒煮汁培养基I麦粒50g，MgSO40.375g，KH2PO40.25 g，蛋白胨0.5 g。

1.2.6.9 麦粒煮汁培养基Ⅱ 麦粒25g，MgSO40.375g，KH2PO40.25 g，蛋白胨0.5 g，H2O250 mL。

1.2.7 碳源、氮源对ZMM-3菌株生长的影响 以基础培养基中20 g葡萄糖为标准，分别以等量的蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、果糖、乳糖代替基础培养基中的葡萄糖，并以不添加碳源的基础培养基作为对照；以基础培养基中2 g蛋白胨的含量为标准，分别以等量的硝酸钾、尿素、硫酸铵、硝酸铵、酵母粉代替基础培养基中的蛋白胨，并以不添加氮源的基础培养基作为对照，将菌饼接入平板中央，每处理重复3次，观察记录菌落形态特征，并对菌丝的日生长速度进行测定。

1.2.8 不同碳氮比对ZMM-3菌株生长的影响 在基础培养基中添加不同质量的蛋白胨（蛋白胨含碳量忽略不计）配制成培养基碳氮比为10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，观察不同碳氮比对毛头鬼伞菌丝生长的影响；每个处理重复3次，观察记录菌落形态特征，并对菌丝的日生长速率进行测定。

1.2.9 不同温度和pH对ZMM-3菌株生长的影响

以基础培养基为标准，（1）大范围的温度筛选：采用PDA培养基，用直径为7 mm的无菌打孔器制作大小相同的菌饼，并把活化好的菌饼分别接于5，10，15，20，25，30，35℃的培养基中，恒温避光培养，每个温度梯度均设置3个重复。（2）小梯度的温度试验：采用PDA培养基，用直径为7 mm的无菌打孔器制作大小相同的菌饼，并把活化好的菌饼分别接于22，24，26，28℃培养箱中，恒温避光培养，每个温度梯度均设置3个重复。另外用2 mol/L的氢氧化钠和盐酸调节培养基的pH值，使其分别为4，5，6，7，8，9，10，接种方法同上，每个处理均设置3个重复。观察记录菌落形态特征，并对菌丝的日生长速率进行测定。

1.2.10 菌丝生长速率的测定 菌丝培养5 d后，测定菌落的直径，并按照下列公式对菌丝生长速率进行计算，最终取3组数值的平均值。

菌丝生长速率（mm/d）＝（菌落直径－7 mm）/2/培养天数。

1.2.11 人工驯化栽培 用长好的麦粒种作为原种对5种供试栽培料进行接种，然后置于温度25℃左右，空气相对湿度为65%～90%的环境下避光培养，观察菌丝在5种不同培养料上的长势、生长速度、菌丝密度、染菌情况以及出菇情况，最后选择最佳栽培料。

1.3 数据分析

应用SPSS 19.0软件进行统计学分析，通过P值是否小于0.05来确定其差异显著性，从而判断其是否具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 ITS序列PCR产物的分析

ZMM-3菌株ITS序列PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后发现，在500～750 bp之间目的条带清晰明亮无拖尾现象（图1），其测序结果如下。

GGACGGGCATCTACTGATTTGAGGCAAAGTT CAATATTGTTGTCCTTTAATAGGACAGTTAGAAGC AGAACACTACAGAGAGCGTTCACAGTCTATGGCG TAGATAATTATCACACCGGTGACGGATCGCAAAC GGTTCCACTAATACATTTCAGGAGAGCTGATCTCG AATGAGACCAGCAAACACTCCCATATCCAAGCCA CAACCAGCAACAAAAGCTGGAGGGGTTGAGAATT TAATGACACTCAAACAGGCATGCTCCTCGGAATA CCAAGGAGCGCAAGGTGCGTTCAAAGATTCGATG ATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGC ATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCGAGAGCCAAG AGATCCGTTGCTGAAAGTTGTATTTTGTTTATAGG CACTGAGGCCCAAATACTTCATTCTACGACATACT AAGTGGTTTATGATAACATAGACCCCAGAGGACG ACATGGCAACAAAAAATTGTCACTAATCAATCCC CCAAGACTACAATGTGTGCACAGGTGGATAGATA AAGACGGCAGGTGTGCACATACTCCTAGGAGTCA GCTACAACCCAACCATGTTTATTCAATAATGATCC TTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTAG。

该序列全长619 bp，通过GenBank BLAST比对发现，该蘑菇与鬼伞属的毛头鬼伞最大同源性高达99%，结合形态特征将其鉴定为毛头鬼伞（Coprinus comatus），即鸡腿菇。

2.2 菌株的形态特征[12]

由图2可知，ZMM-3菌株在PDA培养基上培养8 d后，菌落边缘整齐，菌丝为淡黄色，气生菌丝旺盛，呈棉絮状，质地松散，长时间放置菌落背面会呈黑褐色。

从图3可以看出，菌丝生长健壮，有隔，且隔不等间距，有锁状联合。

2.3 最佳母种培养基的筛选

菌丝在9种不同母种培养基上培养8 d后的菌落形态如图4所示，菌丝在不同母种培养基上的生长情况如表1所示。从图4可以看出，葡萄糖麦芽糖酵母膏混合培养基（F）上的菌丝洁白浓密，菌落边缘整齐且无老化现象，因此，初步将葡萄糖麦芽膏酵母膏混合的培养基作为最适培养基。

表1 9种不同培养基对ZMM-3菌株生长的影响

2.4 碳源对ZMM-3菌株生长的影响

从表2可以看出，ZMM-3菌株在以乳糖作为碳源的培养基上几乎不生长，在其他几种碳源以及无糖培养基上均可生长且生长速率存在显著差异。其中，ZMM-3菌株在以蔗糖为碳源的培养基上菌丝生长速率快，且菌落边缘整齐，菌丝洁白浓密。因此，将蔗糖确定为ZMM-3菌株生长所需的最适碳源。

表2 不同碳源对菌丝生长的影响

2.5 氮源对ZMM-3菌株生长的影响

由表3可知，ZMM-3菌株除在以尿素为氮源的培养基上不能生长外，在其他几种氮源和无氮培养基上均能生长，但生长速率存在差异，其中，在以酵母粉为氮源的培养基上菌丝生长速度最快且菌丝洁白浓密，菌落边缘整齐，因此，酵母粉被确定为该菌株生长的最佳氮源。

表3 不同氮源对菌丝生长的影响

2.6 碳氮比对ZMM-3菌株生长的影响

从表4可以看出，ZMM-3菌株在不同碳氮比的培养基上均能生长，但是菌丝生长速率有差异，且菌丝在碳氮比为10∶1的培养基上生长速率最快，菌丝洁白浓密，菌落边缘整齐，当碳氮比大于20∶1时，菌丝有老化现象，因此，最适碳氮比为（10∶1）～（20∶1）。

表4 不同碳氮比对ZMM-3菌株生长的影响

2.7 不同pH值对ZMM-3菌株生长的影响

从表5可以看出，ZMM-3菌株在pH值为4，5，6，7，8，9，10的培养基上均能生长，但是pH值为4时，培养基呈果冻状，凝固性差，因此，表5中没有对pH值为4的情况下进行数据统计，在其他pH值的培养基上菌丝生长速率存在差异，当pH值为7～8时，菌丝生长健壮且速率最快。

表5 不同pH值对ZMM-3菌株生长的影响

2.8 不同温度对ZMM-3菌株生长的影响

由表6可知，当菌株在5，35℃时菌种不萌发，在10℃时菌种萌发，但菌丝不生长，在15，20，25，30℃时，菌丝均能生长但是生长速率存在明显差异，在25℃时菌丝生长速率最快，且菌丝洁白浓密。30℃时菌丝出现严重老化现象。在小范围温度筛选过程中发现，当温度为22℃时菌丝生长缓慢，当温度高达28℃时菌丝出现老化现象。当菌丝生长温度设定在24，26℃时，菌丝洁白且健壮，生长较快。

表6 不同温度对ZMM-3菌株生长的影响

2.9 不同栽培料对菌丝生长发育的影响[13]

由表7可知，菌丝在5种栽培料上均能生长，但是生长速率存在明显差异，其中，菌丝在稻草培养基上生长速率最快，可以达到约5.7 mm/d。待菌丝长满菌袋进行覆土，12 d后菌袋中出现原基，但只在稻草和玉米秆这2种培养料上出菇并形成了子实体，且生物转化率分别为11.17%和22.28%，因此，将玉米秆确定为最佳栽培料。子实体在分化过程中先分化菌柄，后分化菌盖，在分化菌盖过程中菌柄逐渐变细，菌盖周身有鳞片。毛头鬼伞在生长发育时有幼蕾期、棒状期、梭型期、卵型期、成熟自溶期几个关键阶段[14]。覆土出菇后发现，该菌株子实体多为单生或者丛生，呈棒槌形[15]。菌株高度可达到20 cm左右，菌盖的直径达到5 cm，单菇鲜质量达80 g。

表7 ZMM-3菌株在不同栽培料上的生长情况

3 讨论

本研究结合分子生物学手段和传统的形态观察对ZMM-3菌株进行了分类鉴定，与传统的分类学相比，利用ITS序列鉴定物种相对快捷且准确。桂明英等[16]利用ITS序列成功地鉴定了绵毛蘑菇；王波等[17]通过ITS-RFLP分析对一种野生双孢蘑菇菌株进行了鉴定。本试验还通过对ZMM-3的生物学特性研究发现，菌丝在以乳糖作为碳源的培养基上菌丝不生长，以葡萄糖、蔗糖为碳源的培养基上菌丝长势相对健壮，KAKDE等[18]研究表明，以上述2种糖作为碳源会提高菌丝中脂肪酶的活性，从而促进菌丝的生长。由于不同的真菌参与代谢的酶种类以及酶的活性存在差异，所以，对碳源的吸收利用也存在不同。此外，氮源对于野生食用菌的生长和发育是必不可少的，其既是重要的营养来源，又是合成各种细胞组分的重要元素，如氨基酸、蛋白质、核酸、几丁质以及嘌呤和嘧啶等[19]。研究表明，合适的碳氮源能够增加真菌中的部分生长因子，从而促进菌丝的健壮生长[20]。菌丝在以尿素为氮源的培养基上不生长，在以酵母粉和蛋白胨为氮源的培养基上生长健壮，另外合适的碳氮比也会影响菌丝的生长状况，当碳氮比在（10∶1）～（20∶1）的时候，菌丝洁白浓密，但当碳氮比继续增大时，菌丝会发黄出现严重老化。此外，ZMM-3菌株的最适生长温度为25℃，最适pH值为7～8，在空气相对湿度为65%～90%时，散光照射，覆土后即可出菇形成子实体。本试验为野生食用菌的驯化栽培提供了一定的理论依据。

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Study on Isolation，Identification and Biological Characteristics of a Wild Strain ofCoprinus comatus

CAOJinliang，KANGMan，HANJianrong
（College ofLife Sciences，Shanxi University，Taiyuan 030006，China）

ZMM-3,a large wild strain,was isolated,identified and its biological characteristics were studied.The method of tissue isolation was employed to obtain the ZMM-3 strain.Its Internal transcribed space（ITS）was amplified after the genomic DNA extracted and then sequenced.According to results of ITS sequence and morphological characteristics,ZMM-3 strain was identified as Coprinus comatus.The results showed that the optimum conditions for ZMM-3 strain were the following:temperature of 25℃,sucrose and yeast powder as carbon and nitrogen sources,ratioofcarbon tonitrogen of（10∶1）-（20∶1）,pH 7-8.Finally,the agricultural residues（i.e. cottonseed hull,sawdust,straw,corn cob and corn stalk）were used to cultivate ZMM-3.The results showed that Zmm-3 formed fruiting bodies on straw and corn stalk substrates and the biological conversion rates were 11.18%and 22.30%,respectively.So corn stalk was the optimal material tocultivate ZMM-3.

Coprinus comatus;biological characteristics;identification

S646.1＋5

：A

：1002-2481（2017）01-0024-07

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.01.07

2016-07-29

山西省煤基重点科技攻关项目（FT2014-03-15）

曹晋良（1991-），男，山西保德人，在读硕士，研究方向：资源微生物。韩建荣为通信作者。