解淀粉芽孢杆菌CM3培养基及发酵条件优化

陈哲，梁宏，黄静，赵佳

（山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031）

解淀粉芽孢杆菌CM3培养基及发酵条件优化

陈哲，梁宏，黄静，赵佳

（山西省农业科学院生物技术研究中心，山西太原030031）

为了提高解淀粉芽孢杆菌CM3的抑菌活性，对菌株的培养基组分和发酵条件进行了优化研究。采用单因素试验对菌株菌CM3的所需碳源、氮源、无机盐、培养基初始pH、接种量、培养时间和培养温度进行了筛选，并用正交设计试验对培养基组成以及培养条件进行了优化。结果表明，最终优化后的培养基组分为：玉米粉2%，豆粕0.5%，鱼粉0.5%，NaCl 0.1%；最佳发酵条件：pH值7.0，接种量5%，培养时间48 h，培养温度31℃；在优化后，拮抗细菌CM3的发酵液抑菌圈直径可达到37.58 mm，比优化前提高了22.7%。

解淀粉芽孢杆菌；培养基优化；正交设计

目前，采用微生物防治是治理由大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）引发的黄萎病最有潜力的方法之一[1-6]。解淀粉芽孢杆菌是目前生物防治中比较具有代表性的芽孢杆菌[7]，它具有较强的次生代谢产物产生能力[8]，能产生多种抑菌物质，可以广泛地抑制真菌和细菌的活性[9-11]，因而，其成为具有生物农药开发潜力的微生物[12-14]。

山西省农业科学院生物技术研究中心微生物课题组在研究草莓灰霉病时，从发病植株根际的土壤样品中筛选到了1株拮抗菌，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌，命名为CM3，该菌株具有较强的抑菌活性和较宽的抑菌谱，尤其是其发酵产生的抑菌物质具有很好的稳定性[15]，具有良好的生防产品应用开发前景。

根据研究目的不同，不同菌株所需的最适培养基也不同[16-17]，本研究兼顾提高抗菌活性和降低生产成本2个方面，将大丽轮枝菌作为病原指示菌，通过单因素试验和正交试验优化解淀粉芽孢杆菌CM3的培养基组分和培养条件，研究培养基的碳氮源、无机盐、初始pH、温度、发酵时间及接种量对CM3抑菌活性的影响，以探索菌株CM3抑菌活性达到最大时的最适宜生产发酵条件，旨在为该菌株进行生防菌剂的开发应用提供重要的基础理论数据[18]。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株解淀粉芽孢杆菌CM3由山西省农业科学院生物技术研究中心微生物课题组从土壤中筛选提供。病原菌大丽轮枝菌株由山西省农业科学院棉花研究所保存。

1.1.2 培养基参见沈萍等[19]的《微生物学实验》。PDA固体培养基配方（g/L）：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂8-20）；PD液体培养基配方（g/L）：马铃薯200，葡萄糖20；LB培养基配方（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，用5 mol/L NaOH调pH值至7.0。其中，PDA培养基作为抑菌试验使用的培养基，PD培养基作为指示菌的培养基，LB培养基作为拮抗菌的基础培养基，拮抗菌的发酵培养基根据试验结果自行选择。

1.2 试验方法

1.2.1 种子培养配制PD培养基，湿热灭菌，121℃，20 min。从平板上用接种环取单菌落接种于装有培养基的三角瓶中，振荡均匀制成菌悬液。200 r/min，30℃，摇床培养18 h，备用。

1.2.2 发酵培养将配制好的发酵培养基装入150 mL三角瓶中，装瓶量为50 mL，调pH值至7.2，湿热灭菌，121℃，20 min。用灭菌的移液管将培养好的液体菌种按2%的接种量接种于装有发酵培养基的三角瓶中。振荡均匀制成菌悬液。200 r/min，30℃，摇床培养48 h，备用。

1.2.3 抑菌试验测定方法从病原菌的平板上用接种环刮取菌丝，接种于PD培养基中，培养24 h，备用。根据需要放置好牛津杯。将菌悬液倒入恒温于50℃左右的灭菌PDA培养基（含有0.8%的琼脂），混匀后倒入放置好牛津杯的平皿中，制成含有病原菌的PDA培养平板。将CM3发酵72 h后的发酵液于4 000 r/min离心25 min，收集上清液并用0.45 μm微孔滤膜过滤。取200 μL过滤后的发酵液注入小孔内。培养2 d后，测量抑菌圈直径，并记录试验结果。

1.2.4 菌株CM3的培养基组分优化按照1.2.2中的方法进行发酵，并测定发酵液的抑菌活性。

1.2.4.1 最适碳源的测定配制7种不同碳源的发酵液，分别以1%的可溶性淀粉、土豆淀粉、麦芽糖、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、玉米粉、红糖作为发酵液的不同碳源；1%的胰蛋白胨作为氮源。

1.2.4.2 最适氮源的测定配制8种不同氮源的发酵液，分别以1%的尿素、豆粕粉、鱼粉、大豆蛋白胨、鱼蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、牛肉浸膏作为发酵液的不同氮源，碳源为1.2.4.1试验中测出的最适碳源，浓度为1%。

1.2.4.3 最适无机盐的测定配制6种不同无机盐的发酵液，分别以FeSO4·7H2O，NaCl，MgSO4· 7H2O，KCl，CuSO4·5H2O，CaCl2作为发酵液的不同无机盐，其中，NaCl，MgSO4·7H2O，KCl的质量浓度为1 g/L，FeSO4·7H2O，CuSO4·5H2O，CaCl2的质量浓度为0.1 g/L。1.2.4.1和1.2.4.2测定出的最适碳源和氮源浓度分别为1%。

1.2.4.4 单因素的最佳浓度确定试验筛选的最佳碳源、氮源和无机盐设定不同浓度配制成不同浓度碳源、氮源和无机盐培养基进行发酵，测定不同浓度碳源、氮源和无机盐发酵液的抑菌活性。碳源质量浓度为5，10，20，30，40 g/L；氮源质量浓度豆粕粉为2，5，10，15，20 g/L，鱼粉为1.0，2.5，5.0，7.5，10.0，12.5 g/L；无机盐浓度为0.5，1，5，10，15 g/L。每个试验重复3次，测定发酵液的抑菌圈。

1.2.4.5 培养基浓度正交试验采用L9（34）对碳、氮源和无机盐浓度的组合进行优化。每个试验重复3次，测定发酵液的抑菌圈。

1.2.5 菌株CM3的培养条件优化对于菌株CM3，培养条件主要考察培养基的初始pH、培养温度、培养时间、接种量4个因素。

培养基的初始pH值：3，4，5，6，7，7.5，8，9，10；培养温度：接种后分别在22，25，28，31，34，37，42℃条件下发酵；菌株CM3菌液接种后分别发酵12，24，36，48，60，72，84，96，108 h；接种量：将菌株CM3菌液按照1%，2%，5%，7%，10%和15%6个接种量接种。以上试验均重复3次，测定发酵液的抑菌圈大小，根据结果在每种因素中选择4个水平进行L16（44）正交试验对培养条件进行优化，找出菌株CM3培养条件的最佳组合。

1.2.6 优化结果的比较测定以最适碳源、氮源、无机盐配制发酵培养基，在1.2.5中确定下来的最适培养条件下，对拮抗菌株CM3进行液体发酵培养，测定发酵液的抑菌活性，判断优化后的培养基对菌株CM3抑菌活性的影响。

2 结果与分析

2.1 CM3菌株的生长曲线测定

解淀粉芽孢杆菌CM3的生长曲线如图1所示。由图1可知，在接种后0～6 h为生长的延滞期；6～18 h进入对数期，菌体数量呈对数增长；20 h以后为菌株CM3的生长稳定期。因此，通过该研究结果可以确定种龄18 h的培养液可作为种子液。此时发酵液有较高的菌体浓度，同时拥有旺盛的增殖能力，并且菌体生长状态基本一致。

2.2 发酵培养基的培养基组分优化

2.2.1 碳源的确定本试验中初始发酵培养基为PD培养基，在单因素试验中将其作为对照。

从图2可以看出，当碳源是可溶性淀粉和玉米粉时，菌株CM3在培养基中发酵产抗真菌活性物质的能力更强。相对其他碳源，玉米粉是一种复合碳源，不仅含有玉米淀粉，还含有少量氮源和其他生长因子，能够促进抗真菌活性物质的产生；此外，玉米粉相对廉价易得，具有大量发酵的潜力，所以，选择玉米淀粉作为最佳碳源。

2.2.2 氮源的确定从图3可以看出，当大豆蛋白胨和尿素作为氮源时，菌株CM3产生抑菌物质的能力较弱；当鱼蛋白胨作为氮源时，菌株CM3的抑菌圈最大；而菌株CM3在其余几种氮源的培养基中，抑菌能力相似，相比较而言，豆粕粉的成本较低，是生产中较为常见的氮源。但是考虑到要尽可能提高菌株CM3的抑菌能力，可以在发酵液中适当添加一些其他氮源，例如可以添加适量的鱼粉用来提高抑菌能力。

2.2.3 无机盐选择不同种类的无机盐对菌株CM3的抑菌活性影响不大，基本都与对照（发酵液采用玉米粉、豆粕粉和鱼粉作为碳源和氮源）一致（图4）。综合考虑，可以选择钠离子作为无机盐添加到菌株CM3的发酵液中。

2.2.4 碳源、氮源和无机盐的最佳浓度确定从图5，6，7，8可以看出，玉米粉采用1%，2%，3%（10，20，30 g/L）3个水平进行正交试验，豆粕粉选择0.5%，1%，1.5%（5，10，15 g/L）3个水平进行正交试验，鱼粉采用0.25%，0.5%，0.75%（2.5，5，7.5 g/L）3个水平进行正交试验，钠盐选取0.1%，0.5%，1%（1，5，10 g/L）3个水平进行正交试验比较合理。

2.2.5 培养基浓度正交试验本试验采用正交试验法来找出不同成分的最佳组合，从而确定培养菌株CM3的最佳培养基（表1）。

通过极差分析可知，RB＞RA＞RC＞RD，4种营养成分改变对抗菌物质产量的影响大小依次为豆粕粉＞玉米粉＞鱼粉＞钠盐，即豆粕粉的含量变化对菌株CM3产生抗菌物质的影响较大，而无机盐含量变化对产抗菌物质的影响相对较小。从表1可以看出，A2B1C2D1为最佳搭配，即玉米粉2%，豆粕粉0.5%，鱼粉0.5%，钠盐0.1%。方差分析结果显示，豆粕粉对于菌株活性的影响显著（表2）。

表1 L9（34）正交试验设计结果

表2 L9（34）正交试验结果方差分析

按照最佳搭配A2B1C2D1进行发酵液抑菌试验，选取正交试验中抑菌圈最大的2个组合一起进行比较，结果如表3所示。由表3可知，尽管最优组合的抑菌圈大小较其他处理提高的比例很小，但是最优组合A2B1C2D1确实比其他2个组合A2B1C2D3和A1B1C1D1的抑菌活性大；比PD培养基的抑菌圈提高了20.3%。

表3 菌株CM3在不同组合培养基中的抑菌活性

2.3 发酵培养基的培养条件优化

2.3.1 培养基初始pH培养基不同初始pH对菌株CM3的抑菌活性影响较大。从图9可以看出，在pH值6.5～8.0时抑菌活性较好，抑菌圈大小基本在27～30 mm，表明该pH值范围最适合菌株CM3抑菌活性物质的产生。因此，选择pH值6.5，7.0，7.5，8.0进行正交试验。

2.3.2 培养温度从图10可以看出，温度对于菌株CM3抑菌活性的影响不大，综合考虑，选择25，28，31，34℃这4个温度进行正交试验。

2.3.3 培养时间由图11可知，菌株CM3的培养时间到24 h后，即进入稳定生长期（20 h）4 h后开始出现明显的抑菌圈，在24～48 h内，发酵液的抑菌活性逐渐上升，当培养时间在48～84 h时，抑菌活性达到最大并保持稳定，超过84 h后抑菌活性开始明显下降。所以，结合菌株CM3的生长曲线，选取48，60，72，84 h这4个水平进行正交试验。

2.3.4 接种量从图12可以看出，当接种量为2%时，菌株CM3的抑菌活性就能达到最大值，之后随着接种量的增加，菌株的抑菌活性并没有提高，基本保持稳定；当接种量达到15%，抑菌活性开始降低，抑菌圈大小开始下降。因此，接种量选择2%， 5%，7%，10%这4个水平进行正交试验。

2.3.5 培养基浓度正交试验本试验使用正交试验法以找出菌株CM3培养条件的最佳组合，从而确定培养菌株CM3抑菌活性最好的生长条件（表4）。

表4 L16（44）正交试验设计及结果

通过极差分析可知，RD＞RC＞RB＞RA，4个培养条件中，对抑菌活性影响最大的是接种量，其次依次是培养温度和培养时间，培养基初始pH的影响最小。从表4可以看出，A2B1C3D2为最佳搭配，即菌株CM3的最佳培养条件为：初始pH值7，培养时间48 h，培养温度为31℃，接种量为5%。方差分析结果显示，4个培养条件对于抑菌活性的影响都显著，接种量的影响最大（表5）。

表5 L16（44）正交试验方差分析

2.3.6 优化结果的比较测定优化后的培养基配方为：玉米粉2%，豆粕粉0.5%，鱼粉0.5%，钠盐0.1%；培养条件为：初始pH值7，培养时间48 h，培养温度31℃，接种量5%。由表6可知，菌株CM3的抑菌活性在优化后的培养基（命名为YDY培养基）中确实得到了提高，抑菌圈比PD培养基提高了22.7%；YDY抑菌圈远远大于常规培养基，比NB培养基和LB培养基分别提高了33.1%和94.5%。

表6 菌株CM3在不同培养基中的抑菌活性

3 讨论

有研究表明，不同的培养条件、不同的碳源、氮源和无机盐以及组分之间的不同配比，都会对拮抗菌的抑菌活性造成较大的影响[20-24]。本试验通过摇瓶发酵对菌株CM3的培养基组分和培养条件进行了初步研究，采用牛津杯抑菌法对菌株的抑菌活性进行检测。先通过单因素试验确定了菌株CM3的最佳碳源、氮源和无机盐，在选择碳、氮源时，已经考虑到未来生产成本问题，经过综合考量，选择了玉米粉、豆粕粉和鱼粉、钠盐，最后得到的最佳培养基成分为：玉米粉2%，豆粕粉0.5%，鱼粉0.5%，钠盐0.1%，其中，只有豆粕粉的含量变化对菌株CM3抑菌活性影响显著，说明菌株CM3更加需要迟效碳源，这与张冬冬等[25]和孔少元等[26]的研究结果类似。更重要的玉米粉和豆粕粉这2种天然原料的选择符合了降低生产成本的需要，而鱼粉也是饲料中常用的一种成分，可以说菌株CM3培养基组分的成本较低，具备了进行规模生产的要素。

同样，选择培养基的初始pH、培养温度、培养时间、接种量4个因素对菌株CM3的培养条件进行优化，得到了最优培养条件：初始pH为7，培养时间为48 h，培养温度为31℃，接种量为5%，这4个因素对菌株CM3抑菌活性影响均为显著，其中影响最大的是接种量，说明菌株CM3的培养条件对其分泌产生抑菌物质更为关键。pH值为7说明菌株CM3更适合中性的培养基，偏酸或者偏碱都会对抑菌活性造成影响，更加适合在土壤中定殖[27-28]。从培养时间上分析发现，菌株CM3发挥抑菌作用的时间较短，与其他菌株相比这是一个较大的优势，可以更早地发挥功能[29]。一般来说，微生物在土壤表层以下10～20 cm处生存力旺盛，越到表层由于温度越高越不易存活，菌株CM3的最优温度比一般细菌要高些，说明其在土壤中的存活能力更强，存活的范围更加广泛，适应能力更好些。

优化后的培养基（YDY培养基）确实提高了菌株CM3的抑菌活性，抑菌圈增加到了37.58 mm，较之前提高了22.7%，并且与其他常规培养基相比，提高效果十分显著，为利用菌株CM3进行生物防治奠定了坚实的基础[30]。

菌株CM3是一株生长稳定、抑菌活性良好的拮抗菌，希望能够将其开发成微生物制剂推广到生产实践中，探索其大规模生产的条件就是下一步的重点。本研究已经考虑到了生产成本的问题，但若是要实际生产还需要进行大量的研究，得到更优和更廉价的发酵条件，才能降低成本、便于更好地推广应用。

4 结论

本研究结果表明，菌株CM3对大丽轮枝菌有良好的抑制作用。经过优化后的培养基组分为：玉米粉2%，豆粕0.5%，鱼粉0.5%，NaCl 0.1%；最佳发酵条件为：pH值7.0，接种量5%，培养时间48 h，培养温度31℃。在优化后，拮抗细菌CM3的发酵液抑菌圈直径可达到37.58 mm，较优化前提高了22.7%。

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Optimization of Medium and Fermentation Condition for Bacillus amyloliquefaciens CM3

CHENZhe，LIANGHong，HUANGJing，ZHAOJia

（Research Center of Biotechnology，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031，China）

The study aims to optimize the fermentation conditions of Bacillus amyloliquefaciens CM3 and determine the suitable fermentation medium composition.The strain CM3 could inhibit the activity of Verticillium dahliae,so the inhibition zone diameter was used as index.The suitable carbon source,nitrogen source,inorganic salts,medium initial pH,inoculum,incubation time and culture temperature were screened by single factor test.Then medium composition and culture conditions were optimized by orthogonal design experiment.The results showed that the optimal fermentation conditions were as follows:corn flour 2%,soybean 0.5%,powder of fish 0.5%,NaCl 0.1%,pH 7.0,inoculum 5%,culture time 48 h,culture temperature 31℃.Under these conditions,the inhibition zone diameter of bacterial CM3 increased to37.58 mm,which was improved by22.7%.

Bacillus amyloliquefaciens;medium optimization;orthogonal design

S476

A

1002-2481（2016）11-1577-07

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.11.01

2016-06-29

山西省科技自主创新能力提升项目（2015zzcx-22）；山西省农业科学院科技攻关项目（YGG1414）

陈哲（1984-），女，山西太原人，助理研究员，硕士，主要从事拮抗菌抑菌物质的研究工作。