姜黄提取散中姜黄素在草鱼体内的药代动力学及组织分布

余少梅，高银爱，魏朝辉,，周裕和,，罗杨志，董 军，张立强,，邓 平,，胡亦清，郑程鹏,，喻运珍,

(1.武汉中博水产生物技术有限公司，武汉 430207；2.武汉市农业科学院，武汉 430207)

姜黄素具有抗炎、抗微生物、抗肿瘤、抗氧化、清除自由基等多方面的药理作用，因此被广泛应用于食品、医药等领域。近年来，姜黄素在水产上应用的研究逐渐增多，研究表明姜黄素可以显著提高黄颡鱼()的生长性能、消化能力以及抗氧化能力；提高大菱鲆幼鱼的血清抗氧化能力；对水产主要致病菌嗜水气单胞菌()、鳗弧菌()、迟缓爱德华氏菌()具有一定的抑菌作用；能促进尼罗罗非鱼幼鱼生长性能的提高，可有效地抑制诱导的鱼肝组织的脂质过氧化；对诱导的草鱼肝损伤具有保护作用，由此可见姜黄素具有开发为水产用药的潜力。目前姜黄素在大鼠()、小鼠()、家兔()、人()上均有药代动力学的相关研究，但是关于其在水产动物体内的药代动力学研究却很少见。姜黄提取散是由姜黄醇提物加辅料制备而成，其主要活性成分为姜黄素，应用于水产动物保肝护肝。本研究考察了姜黄提取散口灌给药后，姜黄素在草鱼()体内的药代动力学及组织中分布规律，以期为姜黄提取散临床用药方案的制定提供数据支撑，同时也弥补了姜黄素在草鱼体内药代动力学这一研究空白，为姜黄素水产用相关制剂的开发提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

草鱼来自武汉市农业科学院江夏山坡基地，体质量(104.37±22.06)g，实验前在水族箱中暂养一周。实验用水为曝气48 h自来水，连续充氧，保持水中溶氧大于5.0 mg/L，水温(25±1)℃，pH值7.5～8.0，实验过程中停食。

1.1.2 试验药物与试剂

姜黄提取散(姜黄素含量为10%，由本实验室制备)；姜黄素标准品(纯度≥98.9%，中国食品药品检定研究院)；姜黄素-D6(纯度≥99.5%，加拿大Toronto Research Chemicals)；肝素钠(>99%，上海索莱宝生物科技有限公司)；乙腈、正己烷(色谱纯，Fisher ChemAlert公司)；冰醋酸、甲醇(国药集团化学试剂有限公司)。

姜黄素标准储备液：精确称取姜黄素标准品用甲醇溶解定容，配制成100 μg/mL标准储备液。

内标(姜黄素-D6)储备液：精确称取姜黄素-D6标准品用甲醇溶解定容，配制成12 μg/mL储备液。

1.1.3 试验仪器

氮吹仪(AGC-12D，天津恒奥科技发展有限公司)；旋涡混合器(QL-901，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；三重四极杆液相色谱质谱联用仪：配有电喷雾离子源(ESI)(Waters)；分析天平(JH502，江苏三爱思科学仪器有限公司)；冷冻离心机(CR21N，日立)；可调高速匀浆机(FSH-2，常州智博瑞仪器制造有限公司)。

1.2 给药与采样

姜黄提取散用少许乙醇溶解后用蒸馏水稀释至20 mg/mL(以姜黄素计)混悬液。按100 mg/kg鱼体重(以姜黄素计，下同)，即50 μL/10 g鱼体重单次给药，将药物用1 mL注射器接硅胶软管从草鱼口中注入，注意深度，无回吐鱼可用于实验。

分别于给药后20 min、40 min、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h、17 h、24 h、48 h，草鱼尾静脉取血，1%肝素钠抗凝后4 000 r/min离心10 min，取上清；同时解剖分离出肌肉、皮、肝脏、肾脏；以上样品于-20 ℃下冷冻保存。

每一时间点各取5尾鱼，作为5个平行样品分别处理测定。另取5尾未给药鱼作空白对照。

1.3 样品处理

样品处理参照刘永涛等方法，略作调整。

1.3.1 血浆样品

样品在室温下自然解冻，摇匀后移取0.5 mL血浆样品于15 mL离心管中，加入100 μL姜黄素-D6溶液(250 μg/L)，加入4.5 mL乙腈(0.01%冰醋酸)，涡旋30 s，4 000 r/min离心10 min，转移提取液至另一10 mL离心管中，重复提取一次，合并提取液，置于氮吹仪45 ℃吹至干，用1 mL 75%乙腈溶解残渣，溶液转移至1.5 mL离心管中，15 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜，待测。

1.3.2 组织样品

样品在室温下自然解冻，准确称取2 g肌肉，或0.5 g鱼皮、肝脏或肾脏样品于15 mL离心管中，加入100 μL姜黄素-D6溶液(250 μg/L)，加入5 mL乙腈(0.01%冰醋酸)，匀浆30 s，4 000 r/min离心10 min，转移提取液至10 mL离心管中，重复提取一次，合并提取液，置于氮吹仪45 ℃吹至干，用1 mL 75%乙腈溶解残渣，再加入0.5 mL正己烷，涡旋30 s，4 000 r/min离心10 min，弃去上层正己烷层，溶液转移至1.5 mL离心管中，15 000 r/min离心10 min，取上清液过0.22 μm滤膜，待测。

1.4 检测方法建立

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Xbridge BEH C18 2.5 μm，2.1×50 mm；流动相A：10 mmol/L甲酸铵溶液(0.1%甲酸)；流动相B：乙腈(0.1%甲酸)；柱温：40 ℃；进样量：1 μL；洗脱方式：梯度洗脱程序，7.5 min，见表1。

表1 洗脱程序

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾(ESI)；扫描极性：正离子模式；扫描方式：多反应检测(MRM)；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：150 ℃；脱溶剂气温度：400 ℃；脱溶剂气流速：800 L/h；锥孔气流速：150 L/h；碰撞气流速：0.13 mL/min；质谱多反应检测离子对：见表2。

表2 检测离子对

1.4.3 标准曲线制备

精确量取姜黄素标准储备液和内标液，用空白基质定容，配制成姜黄素浓度分别为0.05、0.50、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/L，姜黄素-D6均为250.00 μg/L的浓度。将上述标准溶液注入液相色谱-质谱仪中进行分析测定，记录色谱峰面积。以姜黄素质量浓度为横坐标()，以姜黄素和姜黄素-D6响应值之比为纵坐标()，进行线性回归，求出回归方程和相关系数。用空白组织制成低质量浓度药物的含药组织，经预处理后测定，将引起三倍基线噪音的药物的质量浓度定义为最低检测限。

1.4.4 回收率和精密度测定

分别在草鱼空白血浆、肌肉、肝脏、肾脏、皮中加入姜黄素标准溶液及内标溶液，使姜黄素质量浓度()为0.05、5.00、50.00 μg/kg，每个浓度3个平行，按样品处理方法处理后测定，得到三个浓度水平的测定值()，回收率=/×100%。每个浓度的样品，于同1 d不同时间段连续测定 3 次，计算得日内精密度；1周内重复测3次，计算得日间精密度。

1.5 数据分析

根据给药后各时间点姜黄素的血药浓度绘制血药浓度-时间曲线，主要药动学参数用药代动力学分析软件(WinNonlin5.2.1)进行处理。

2 结果与分析

2.1 样品色谱图

图1是不同鱼体组织中阳性样品的色谱图。不同组织中测定峰均不受组织基质影响，峰型尖锐，杂峰少。

图1 不同草鱼组织样品中姜黄素色谱图

2.2 标准曲线

姜黄素标准曲线方程为：=1 2042+4983，=0.999 1，在0.05～50.00 μg/L范围内线性关系良好，血浆中姜黄素检测限为0.02 μg/L，鱼肉、鱼皮、肾脏、肝脏中检测限为0.02 μg/kg。

2.3 方法回收率与精密度

经测定，血浆、鱼肉、肝脏、肾脏、鱼皮三个质量浓度水平下平均回收率分别为97.13%～104.07%、97.4%～101.97%、78.73%～85.2%、77.16%～88.53%、95.07%～106.10%，相对标准偏差为1.65%～4.85%、3.36～6.12%、3.00%～7.48%、3.94%～6.95%、1.93%～9.83%。

日内精密度分别为0.86%～3.35%、1.23%～5.35%、3.23%～7.14%、2.39%～6.25%、0.96%～5.67%、日间精密度分别为3.04%～9.05%、2.35%～8.54%、1.37%～7.85%、1.54%～7.62%、4.68%～9.62%，日内、日间误差均小于10%。

2.4 姜黄素在血液中药代动力学

草鱼100 mg/kg单剂量口灌姜黄提取散后，血浆中姜黄素浓度-时间曲线见图2，经WinNonlin5.2.1非房室模型分析得到的主要药动学参数见表3。给药后8 h，姜黄素在血液中达到峰值，峰浓度为0.406 μg/L，消除半衰期为21.596 h，姜黄素在草鱼血液中达峰时间长，峰浓度低，体内消除快。表观分布容积为377 795.553 L/kg，大于1.00 L/kg，说明姜黄素在组织中的分布浓度大于血浆，在组织中分布广泛(Vz_F_obs：0.80～1.00 L/kg，药物在体内均匀分布；>1.00 L/kg，组织中的药物浓度大于血浆)。

图2 草鱼口灌单剂量姜黄提取散后血药浓度时间曲线

表3 姜黄素在草鱼体内主要药代动力学参数

2.5 姜黄素在组织中分布情况

草鱼口灌姜黄提取散后，姜黄素在鱼肉、鱼皮、肝脏、肾脏中均有分布，浓度呈现先升高后降低的趋势，并在2 h和24 h分别出现峰值(图3)。8 h前，同一时间点姜黄素浓度肝脏>肾脏>鱼皮>鱼肉，8 h后肾脏>肝脏>鱼皮>鱼肉。姜黄素体内最大峰浓度分别如下，血浆0.406 μg/L，肉11.32 μg/kg，皮52.68 μg/kg，肾脏139.78 μg/kg，肝脏190.02 μg/kg。姜黄素在肝脏和肾脏中分布较多，血浆、肉和皮中分布较少。

图3 草鱼组织中姜黄素浓度时间曲线

3 讨论

3.1 草鱼组织中姜黄素检测方法建立

在预实验中发现草鱼口灌姜黄提取散后，组织中姜黄素含量较低，当用高效液相色谱检测时，组织中低浓度的姜黄素难以检测出来，故选择液相色谱-质谱联用法进行检测，经优化该方法在血浆中检测限可达0.02 μg/L，鱼皮、鱼肉、肝脏和肾脏中检测限可达0.02 μg/kg，优于超高效液相色谱法(检测限是0.010 mg/kg)。比较了梯度洗脱和等度洗脱，1 μg/L和10 μg/L姜黄素标准溶液在梯度洗脱条件下，峰型和响应度均较好，因此选择梯度洗脱方式。在采用外标法检测时发现肝脏组织加标回收率只有51.4%～68.3%，考虑到样品处理过程中操作较多，会引起操作误差，故在样品中加入同位素标记的姜黄素-D6作为内标，经考察确定样品中加入量为25 ng时，内标响应值和峰型均可达到检测需求，最终建立方法的加标回收率可达77.16%～106.10%。该方法回收率高、重复性好、灵敏度高，能够满足草鱼组织样品中姜黄素含量的测定。

3.2 姜黄素在草鱼体内药代动力学特征及组织分布

达峰时间()是衡量药物在体内吸收速度的重要参数之一，消除半衰期()是反映机体对药物消除速率的一个重要参数。草鱼单剂量口灌100 mg/kg姜黄提取散后，姜黄素在血浆中达峰时间为8 h，峰浓度为0.406 μg/L，消除半衰期为21.596 h；张立康等给大鼠灌胃200 mg/kg姜黄素，达峰时间为32 min，峰浓度为0.7 mg/L，消除半衰期为90.79 min；赵自明等给家兔灌服复方姜黄素片，血药浓度分别在20 min和45 min达到峰值，最大浓度为6.1 ng/mL，消除半衰期为25.07 h。可以看出，同为口灌给药，姜黄素在草鱼体内吸收较大鼠、家兔缓慢，达峰时间长，峰浓度低，消除较大鼠慢，较家兔快。而同为大鼠给药，得到的结果也不相同。姜黄素在草鱼、大鼠血液中只有一个峰值，而在家兔血液中呈现两个峰值。这些药代动力学过程的差异可能与给药对象种属、给药浓度、给药剂型等均有关系。

姜黄素血浆峰浓度较低，表明姜黄素吸收入血的量很少，这一点从偏高的表观分布容积也可以看出。表观分布容积是反映药物在体内分布情况的重要的物理量。当>1.00 L/kg，表示药物集中分布在某个器官或大范围组织内。本研究中姜黄素在草鱼体内表观分布容积为377 795.553 L/kg，极大于1.00 L/kg，推测一种可能是灌胃后，部分药物未被吸收，直接通过胃肠道排出，进入血液中姜黄素含量低，导致计算得到的表观分布容积偏高。同理，计算得到的总体清除率也较大。另一种可能是体内姜黄素集中于某一器官或组织中，具体为哪种有待进一步研究。

草鱼血液中姜黄素达峰时间晚于其它组织，且峰值也比其它组织中低，推测进入血液中的姜黄素会迅速分布到其它组织，刘玉林等在诺氟沙星在大黄鱼体内药代动力学研究中得到相似结果。姜黄素在肝脏、肾脏、鱼皮、鱼肉中分布呈现双峰现象，可能与口服药物的肝肠循环、胃肠道多位点吸收、药物制剂等有关。肾脏和肝脏中浓度高于鱼肉和鱼皮，这可能是因为肝脏和肾脏是负责将药物从机体里清除的器官；并且肝脏和肾脏渗透性好且含丰富的血管，所以药物比在渗透性差、血管贫乏的肌肉和皮中分布的多。秦方锦等认为组织器官结构和功能的不同，对药物的处置也各不相同，使其对药物的代谢及分布具有明显的组织特异性。多个研究表明姜黄素具有保肝护肝作用，能够抗炎、抗脂质过氧化，保护肝细胞免受损伤；抑制肝星状细胞的增殖和活化，诱导其凋亡，阻止肝纤维化发生。作为姜黄素的靶器官之一，用药后试验草鱼肝脏中姜黄素含量最高，这恰好有利于姜黄素保肝护肝作用的发挥。另外，鱼皮中姜黄素含量相对较高，同一时间点均高于鱼肉。喻鹏飞等研究发现姜黄素对水产致病菌嗜水气单胞菌、鳗弧菌、迟缓爱德华氏菌均具有抑制作用。鱼皮对姜黄素的吸附提示，对于水产动物体表细菌引起的病灶，能否采用浸泡给药的方式予以治疗，有待进一步研究。