三氯生对雄性斑马鱼鳃组织凋亡相关基因表达的影响

刘海芳，王 凡，姚卫云

(1.中原工学院，郑州 450007；2.洛阳师范学院，河南洛阳 471022)

三氯生(triclosan，TCS)，又名三氯新，被广泛应用于各类医疗用品和生活日用消费用品中[1-2]。由于TCS的大量使用使其在各个环境介质中普遍存在，其主要通过污水厂出水排放进入水体和土壤中。目前，已在污水处理厂进出水、污泥、河流、河口、沉积物及生物体中检测到TCS的存在，且其在污水处理厂进出口水区域的最高浓度可达27 μg/L[3]。现已证实，TCS具有生物蓄积性、稳定性和多种其他生物毒性。因此，关于TCS环境行为、生态毒理、健康安全评价等研究已经引起广泛关注。

近年来许多学者已经报道了TCS的生物毒效应。刘飞等[4]研究证实TCS对红白鲫具有潜在的遗传毒性，且随着在TCS暴露浓度的增加，其毒性效应也随之而增强。危玲等[5]的综述表明TCS是一种影响生殖的内分泌干扰物。陈建军等[6]研究发现TCS具有显著的生理毒性，能够抑制泥鳅(Misgurnusanguillicaudatus)肝组织中的谷草转氨酶和谷丙转氨酶活性。Alice等[7]发现TCS能够降低鱼类孵卵率以及延长孵化时间，对鱼类产生显著的繁殖和发育影响。迄今为止，对于硬骨鱼类TCS分子生物毒性的研究相对较少，尤其在鱼类凋亡相关基因的表达影响方面。

斑马鱼(DanioRerio)是一种实验室常用的模式动物，它与人类基因高度相似，经常被应用到毒理学和药理学的研究中。鳃作为鱼类最重要的呼吸器官，可直接反映水体污染物对鱼体的毒害程度，通常作为鱼类毒性效应研究的主要靶器官之一[8]。因此，本研究以斑马鱼为研究对象，利用PCR技术探讨不同浓度的TCS对于斑马鱼鳃组织促进和抑制细胞凋亡相关基因表达的影响，其主要目的是揭示TCS对于鳃组织损伤的相关分子机制，同时也为TCS对人类健康提供安全性评价提供支撑材料。

1 材料和方法

1.1 研究对象

试验用鱼购自上海诚信渔场，体长为1.5～2.1 cm，暂养于实验室玻璃水族箱中驯化7 d，每日定时投喂饵料两次，吸出饵料残渣、排泄物等，每日用曝气72 h的自来水更换养殖用水，水温(22±3)℃，pH值6.9±0.2，24 h不断充氧，并确保溶氧量>5 mg/L。然后取大小相似、行为迅速敏捷、健康状况良好的斑马鱼分组进行试验。

1.2 试验试剂

三氯生(美国Sigma公司)、总RNA极速提取试剂盒(上海飞捷生物技术有限公司)、RNA反转录试剂盒(东洋纺生物科技有限公司)、2×Taq MasterMix(北京康为世纪生物科技有限公司)、GoldView I型核酸染色剂、Bestar SybrGreen qPCR mastermix(德国DBI公司)、二甲基亚砜溶剂(天津紫明化工有限公司)、基因引物(华大基因公司)、琼脂糖、Loading buffer染料等。

1.3 实验设计

查阅相关文献得知TCS对斑马鱼96 h LC50为340 μg/L[9]。在此基础上，设置1/20 LC50(17 μg/ L)、1/10 LC50(34 μg/L)、1/5 LC50(68 μg/L)3个TCS处理组(低于安全浓度、安全浓度、高于安全浓度)，并设置空白对照组，每组同时设置两个平行。随机选择暂养后的斑马鱼幼鱼100尾放置于每一浓度组水族箱中，每个水族箱用水量20 L，以半静态水体暴露法对斑马鱼进行连续处理42 d。整个试验期间其他条件同暂养期间。

1.4 样本的制备

TCS处理42 d后，选出行动敏捷、生长状况良好、体表健康的斑马鱼进行解剖。每个浓度斑马鱼均分为五组，并且每组取出5条雄性斑马鱼鳃组织的混合样作为一个样本。然后迅速转移并保存在超低温冰箱中用于后期凋亡相关基因表达的检测。

1.5 凋亡相关基因表达的检测

1.5.1 引物序列

Bcl-2、Bax、p53、MDM2、β-actin(内参)基因的引物序列来自于相关报道[9-10]，详见表1。

表1 PCR所用基因的特异性引物及其序列

1.5.2 RNA的提取与反转录

按照总RNA 极速抽提试剂盒提供的方法，提取每个雄性斑马鱼的鳃组织混合样。对提取出的RNA用凝胶电泳分析其质量，并用超微量分光光度计检测其纯度和浓度。对质量好、浓度适宜、纯度高的RNA样本进行反转录反应。

1.5.3 普通PCR

将反转录得到的cDNA加入目的基因和内参基因的上下游引物、2×Taq MasterMix及无菌水制备25 μL的普通PCR反应体系。将反应体系充分混匀，根据普通PCR步骤进行扩增反应，其扩增反应条件为94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 2 min。扩增完成后进行琼脂糖凝胶电泳反应，电泳完成后观察并保存各个基因的表达结果。

1.5.4 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

为鉴定引物特异性是否符合RT-qPCR实验的要求，在进行正式RT-qPCR反应之前，用实时荧光定量PCR仪来分析上述引物的特异性。结果显示，内参基因与各个目的基因融解峰一致，扩增效率都接近100%，这表明所合成的引物可以用于本研究实验过程中的实时荧光定量PCR反应。为了检验是否可用2-ΔΔct法来计算目的基因的相对表达量，对每个基因做标准曲线，结果发现，各个基因的扩增效率都接近100%，这表明可用2-ΔΔct法来计算mRNA的相对表达量

把反转录获得的cDNA、目的基因和内参基因的上下游引物，Bestar SybrGreen qPCR mastermix以及无菌水，配制20 μL的反应体系进行实时荧光定量PCR反应。反应条件为：95 ℃ 预变性2 min；循环条件：95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，同时检测荧光信号，40个循环反应；融解曲线95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，55～98 ℃(10 s/循环0.5 ℃/循环)86个循环。

1.6 数据分析

对RT-qPCR的Cq值利用2-ΔΔt法进行数据处理。应用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，结果用平均值±标准差来表示，采用LSD法来分析各个浓度组与空白对照组之间的差异，若P<0.05，则为差异显著；P<0.01则为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 目的基因和内参基因的普通PCR反应结果

图1 内参及目的基因在不同浓度组的TCS表达情况

普通PCR结果如图1所示，通过分析每个TCS浓度组Bcl-2、Bax、p53和MDM2基因与内参基因(β-actin)灰度值之比的大小来比较目的基因的相对表达。Bcl-2在各个TCS浓度组的表达量无明显变化；p53在各个TCS浓度组的表达量都有下调趋势，表现差异不明显；MDM2在各个TCS浓度组表达均有上调趋势，但差异表现不明显；Bax在17、34 μg/L的TCS浓度组表达量无明显变化，但在68 μg/L处理组中表达量有下调趋势。以上结果表明，普通PCR并不能显著分析出TCS对斑马鱼鳃凋亡相关基因表达量的影响。

2.2 三氯生对雄性斑马鱼鳃凋亡相关基因表达的实时荧光定量分析

图2 不同TCS浓度组斑马鱼鳃凋亡相关基因mRNA的表达

为了证实TCS对斑马鱼鳃的各种抗氧化基因的表达量的影响，采用RT-qPCR法并分析处理组的表达与对照之间的差异显著性。结果如图2所示，与空白对照组相比，Bcl-2基因在各个TCS浓度处理组表达水平都无显著差异；Bax基因在不同浓度的TCS浓度组中的表达水平均有下调趋势，且在68 μg/L TCS浓度组极显著下调，下调了94.9%；Bcl-2/Bax在17、34 μg/L浓度组中无明显变化，而在68 μg/L TCS处理组极显著上升；p53基因在不同浓度的TCS浓度组中的表达水平均具有下调趋势，其中在68 μg/L浓度下表现为显著下调，基因表达下调了96.3%；MDM2基因在不同浓度的TCS浓度组中的表达水平均具有上调趋势，且在34 μg/L和68 μg/L浓度下表现为极显著上调，其上调幅度分别是空白对照组的6.6倍、10.8倍。

3 讨论

Bcl-2与Bax同属于一个基因家族，在控制细胞凋亡的复杂网络中作用相反。Bcl-2能够抑制细胞色素C的释放，从而起到抑制细胞凋亡的作用[11]。 Bax可以抑制Bcl-2基因的活性，当Bcl-2 与 Bax 形成同源二聚体时，便可诱导凋亡[12-15]，在控制细胞凋亡的复杂网络中Bcl-2与Bax比例的变化会影响细胞凋亡[16]，当Bcl-2/Bax比值上升和下降会对细胞的凋亡分别起到抑制和促进的作用。在本研究中，Bcl-2与Bax基因在不同浓度处理组中的基因表达都有下调趋势；Bcl-2与Bax比值在低浓度呈下调趋势，但在68 μg/L TCS处理组极显著上调。这表明不同浓度的TCS都能够干扰细胞凋亡基因的表达，且可能在低浓度TCS处理组促进凋亡，而在68 μg/L处理组中，可能起到抑制细胞凋亡的作用。刘林等[17]研究的纳米氧化锌能够使斑马鱼肝脏中Bcl-2的表达及Bcl-2/Bax比值下降，表明纳米氧化锌能够促进斑马鱼肝脏细胞的凋亡；鲁疆等[18]的研究发现CdCl2使斑马鱼胚胎Bcl-2的表达及Bcl-2/Bax比值显著下降。上述结果有的方面和本研究结果不太一致，可能是由于污染物浓度、种类、暴露时间长短及鱼的组织不同所造成的。

p53基因是一种抑癌基因，其编码产物是核转录因子[19]，其主要作用是阻滞细胞周期、促进细胞凋亡。另外 p53基因的表达还涉及到维持基因组稳定、细胞自噬、抑制肿瘤血管生成、调节代谢、影响生殖等其他方面作用[20-22]。MDM2基因是一类癌基因，其蛋白表达产物能够抑制细胞的凋亡。MDM2基因与p53 基因在基因表达网络中联系紧密。由MDM2基因编码的MDM2蛋白在细胞内的主要功能是通过调节p53蛋白的稳定性而影响细胞的生长状态[23]，当MDM2基因扩增所导致的基因表达过强则可封闭p53介导的激活作用，使p53功能丧失，导致基因不稳定及细胞增生，从而抑制细胞的凋亡。在本研究中p53基因在3个TCS处理组中的表达水平均有下调趋势，并且在68 μg/L处理浓度组中表现出显著下调；而MDM2基因在三组不同浓度的TCS处理组中的基因表达均有上调趋势，其34 μg/L和68 μg/L TCS处理浓度组中的基因表达量为极显著上调。因此，在较高浓度的TCS处理组中，能够抑制斑马鱼鳃组织的细胞凋亡。该结果也进一步证实了TCS在68 μg/L处理组中，可能起到抑制斑马鱼细胞凋亡的作用。本研究结果表明TCS在斑马鱼安全浓度和高于安全浓度情况下，对鳃凋亡相关基因表达产生显著影响，而该浓度和污水处理厂进出口水区域的最高浓度接近，由于TCS具有蓄积的特性，因此，TCS对污水厂进出口区域生物的分子毒性应该引起重视。

综上所述，TCS对雄性斑马鱼细胞凋亡有关基因的表达具有一定影响，且在高浓度下，其影响程度更为显著。由于影响细胞凋亡的基因较多，控制其基因表达的网络调控较复杂，其调控机制还需更深层次的研究。