鲑鱼甲病毒E1基因高保守区融合表达及免疫特性的分析

蒋　烨，杜　航，唐丽杰，乔薪瑗，王　丽，管雪婷，姜艳平，崔　文，李一经，刘　敏

(1.东北农业大学动物科学与技术学院,哈尔滨　150030;2.东北农业大学动物医学学院,哈尔滨　150030)



鲑鱼甲病毒E1基因高保守区融合表达及免疫特性的分析

蒋烨1，杜航1，唐丽杰2，乔薪瑗2，王丽2，管雪婷1，姜艳平2，崔文2，李一经2，刘敏1

(1.东北农业大学动物科学与技术学院,哈尔滨150030;2.东北农业大学动物医学学院,哈尔滨150030)

摘要：根据GenBank中公布的鲑鱼甲病毒(salmonid alphavirus，SAV)SAV 1、SAV 2和SAV3三个基因型中E1基因，选择高保守序列702 bp(436-1137)合成基因，命名为SAV E1，将其克隆到原核表达载体pCold TF中构建重组质粒。然后将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞BL21中，经终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导表达，SDS-PAGE和Western blot鉴定，重组蛋白均获得了表达，表达E1重组蛋白约95 kD。用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白，制备抗血清。间接ELISA结果显示，鼠抗重组蛋白E1血清效价为1∶25 600；间接免疫荧光结果显示，鼠抗重组E1蛋白血清可与SAV发生特异反应，由此表明表达的E1重组蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性，为SAV检测方法的建立提供理论依据。

关键词：鲑鱼甲病毒(salmonid alphavirus，SAV)；E1高保守蛋白；原核表达；免疫特性

鲑鱼甲病毒(salmonid alphavirus，SAV)隶属于披膜病毒科(Togaviridae)甲病毒属(Alphavirus)，主要感染大西洋鲑(salmosalar)和虹鳟(Oncorhynchusmykiss)引起胰腺、心肌炎症和昏睡等症状，致死率达1%～48%，并在水产养殖的各个阶段均有爆发[1-2]。自从1995年Nelson等在爱尔兰成功分离出该病毒，至此已发现六个基因型(SAV 1、SAV 2、SAV 3、SAV 4、SAV 5、SAV 6)[3-4]。SAV 2、SAV 3可感染虹鳟引起睡病(Sleeping disease，SD)；SAV 1、SAV 2、SAV 4、SAV 5、SAV 6基因型可感染大西洋鲑引起胰腺病(Salmon pancreas disease，PD)。目前该病广泛流行于苏格兰、挪威、爱尔兰、法国等欧洲国家，据统计从1995年至2007年发病率逐年增加高达90%，每年由此疫病造成巨大的经济损失[5-6]。虽然我国目前尚未发现该病，但是随着近年我国对鲑科鱼类进口的增加，该病传入我国的风险也日益增大，因此有必要尽早建立对鲑鱼甲病毒快速灵敏的检测方法，防止该病传入我国。

SAV病毒粒子呈球形，有囊膜，直径为(65.5 ±4.3)nm[7]，能够通过敏感细胞系大鳞大马哈鱼(O.tshawytscha)胚胎细胞(CHSE-214)进行分离和繁殖[8]。SAV是单股正链RNA病毒，基因组长11～12 kb，含有两个开放阅读框。其中3′ 端开放阅读框编码26S子基因的mRNA，最终产生5个结构蛋白，依次是衣壳蛋白，糖蛋白E3和E2、6K和E1，已被证实衣壳蛋白、E1和E2在病毒复制时被表达，其中衣壳蛋白构成病毒的衣壳，E3、E2、6K和E1共同构成了病毒的包膜糖蛋白。E2和E1为跨膜蛋白暴露于病毒粒子表面，E1和E2形成异源二聚体，E2位于远端并且最有可能同细胞的受体互作[9-10]。E2上有绝大部分的中和抗原决定簇，它的作用是识别并同细胞表面的受体结合；而E1中含有较多保守和交叉反应性的抗原决定簇[11]，各亚型之间E1蛋白具有很强的保守性，其中436～1137 bp这段基因在各亚型之间100%保守。

大肠杆菌表达系统成熟完善，具有繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定，目的基因表达水平高，抗污染能力强等优点，被广泛引用于重组蛋白药物的研究和生产[12-13]。大肠杆菌表达系统载体众多，笔者曾尝试多种表达载体表达E1蛋白，如pProEX HTa、Pgex-6p-1和pET系列，但都未获得可溶形式的重组蛋白。本研究利用原核表达载体pCold TF表达SAV E1蛋白的高保守区(702 bp)，获得可溶形式的重组蛋白E1，并制备抗血清，并初步研究重组蛋白E1的免疫特性，为E1蛋白在SAV检测方面的研究奠定基础。

1材料与方法

1.1实验材料

1.1.1毒株、菌株和质粒

SAV1(V4640)毒株由英国苏格兰海洋实验室馈赠；CHSE-214、大肠杆菌感受态细胞TG1、BL21和pCold TF均由本实验室保存。

1.1.2主要试剂

辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG、异硫氰酸突光素(FITC)标记羊抗鼠IgG和HIS标签抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2SAV E1保守基因的设计合成

根据NCBI数据库已公布的SAV E1基因的基因序列及其蛋白空间构象，分析其同源序列及保守区域，选取其共保守序列，设计了共737 bp的DNA序列，包括上下游酶切位点EcoRI、XbaI，终止密码子，其中编码E1基因的碱基702 bp(436～1137 bp)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并连接到克隆载体pUC57。

1.3重组表达质粒pCold TF-E1的构建

重组质粒pUC57-E1与原核表达载体pCold TF，分别用EcoRI、XbaI双酶切，经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，用胶回收纯化试剂盒切胶回收两段目的基因，将E1与pCold TF用T4DNA连接酶连接，16 ℃连接12 h，转化大肠杆菌TG1感受态中，涂布于含有50 g/mL的Amp+LB平板上，待菌液全部被培养基吸收后放入37 ℃培养箱内，倒置培养12 h。挑取单个菌落提质粒，进行单、双酶切鉴定。

1.4重组表达质粒pCold TF-E1的鉴定

随机挑取LB转化平板中的若干菌落，接种于5 mL含100 g/mL Amp的LB培养基中培养8 h，提取质粒。对重组质粒pCold TF-E1进行EcoRI和XbaI单、双酶切鉴定。0.8%琼脂糖凝胶电泳观察单双酶切得到的目的片段大小是否与预期大小相符。测序确定E1基因是否正确的插入到pCold TF载体中。

1.5重组蛋白的诱导表达、纯化及鉴定

重组质粒pCold TF-E1转化到大肠杆菌BL21中后，挑取转化子至含氨苄的LB液体培养基中，37 ℃，200 r/min过夜培养。将过夜培养物按1%的接种量接入10 mL LB培养基，37 ℃振荡培养至OD600约0.4时，取1 mL菌液作未诱导对照，剩余菌液添加IPTG至1 mmol/L，重组大肠杆菌pCold-E1/BL21，16 ℃，200 r/min诱导培养过夜，菌液经超声破碎后，制备蛋白样品，用于SDS-PAGE检测分析。用镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白。

将制备好的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳并转膜，用HIS标签抗体作为一抗，进行Western-blot鉴定。

1.6抗血清的制备

将纯化好的蛋白与等量的弗氏完全佐剂混合充分乳化，腹腔注射6～8周龄BALB/c雌鼠，每只小鼠100 g，分离接种前鼠尾静脉血清作为阴性对照。第一次免疫14 d后，用纯化好的蛋白与等量的弗氏不完全佐剂混合充分乳化进行第二次免疫；之后再隔14 d后用第二次免疫的方法对小鼠进行第三次免疫。第三次免疫后第7天小鼠眼球采血，无菌分离血清，-80 ℃保存。

1.7抗体效价的测定

用重组E1蛋白作为抗原包被ELISA板，用制备好的鼠抗E1蛋白血清和鼠阴性血清作为一抗，HPR标记的山羊抗鼠IgG作为二抗，OPD避光显色。结果判定：当P/N(阳性血清OD490 nm值-空白孔OD490 nm值)/(阴性血清OD490 nm值-空白孔OD490 nm值)>2时，此孔记为阳性孔，阳性血清的最大稀释度即为血清抗体效价。

1.8间接免疫荧光(IFA)检测免疫原性

将无菌玻片放于6孔板中，将CHSE-214细胞接种于6孔板，使其长成致密单层。常规方法接种SAV1，同时设正常细胞对照。15 ℃培养7 d后弃去细胞培养液，用4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗涤3次，每次5 min；每孔加入2%Triton-100，37 ℃10 min，PBS洗涤3次，每次5 min；每孔加入1%BSA，37 ℃封闭1 h，PBS洗涤3次，每次5 min；加入鼠抗E1蛋白血清，37 ℃孵育1h，PBS洗涤3次，每次5 min；加入FITC标记的山羊抗鼠IgG(1∶5000)，37 ℃避光孵育30 min，PBST洗涤3次，每次5 min；在免疫荧光显微镜下观察结果。

2结果与分析

2.1重组表达质粒pCold TF-E1的单、双酶切鉴定

重组表达质粒pCold TF-E1用EcoRI或XbaI单酶切得到6 600 bp的片段，EcoRI和XbaI双酶切得到5 800 bp和780 bp的目的片段(见图1)；结果表明已获得携带有目的基因E1的重组质粒。

图1　重组质粒pCold-E1酶切鉴定结果

M：DNA Marker8000bp；1：EcoRI单酶切结果；2：XbaI单酶切结果；3：EcoRI XbaI双酶切结果

2.2重组蛋白的诱导表达及鉴定

重组表达载体pCold TF-E1中E1基因与His标签、分子伴侣融合表达，His标签蛋白分子量约6 KD，分子伴侣蛋白分子量48 KD，目的蛋白E1约为29 KD，以及HRV 3C蛋白酶、凝血酶，则融合蛋白分子量大小约为95 KD。经IPTG诱导后在约95 KD处出现明显的条带，即为目的蛋白(见图2)。对诱导后的菌体进行超声破碎，pCold-E1/BL21表达的蛋白主要存在于破碎上清，而破碎后的沉淀里只含有很少的一部分，表达形式为可溶形式。

图2　pCold-E1/BL21SDS-PAGE表达鉴定

M：蛋白Marker；1：pCold-E1/BL21诱导前菌体； 2：pCold-E1/BL21诱导后菌体； 3：pCold-E1/BL21超声后上清； 4：pCold-E1/BL21超声后沉淀；

将重组E1蛋白转印至NC膜上，与抗His标签的单抗室温作用2 h，再与辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG室温作用2 h，ECL显色液显色后，可在预期位置观察到明显的特异性条带，表明制备的重组E1蛋白表达(见图3)。

图3　pCold-E1/BL21Western blot表达鉴定

M：蛋白Marker；1:pCold-E1/BL21诱导前菌体；2:pCold-E1/BL21诱导后菌体；

2.3抗体效价的测定

将重组E1蛋白作为抗原，免疫前的鼠血清作为阴性血清，制备的鼠抗E1血清作为待检样品，进行间接ELISA实验。结果表明，制备的鼠抗E1血清与相应的重组E1蛋白有较强的反应性，血清最大稀释度为1∶25 600，即为鼠抗E1蛋白血清效价(见表1)。

2.4间接免疫荧光检测免疫原性

接种SAV 1的CHSE-214细胞和未接种病毒的CHSE-214细胞分别与制备的鼠抗E1血清作用，经间接免疫荧光试验检测，结果显示接种SAV的细胞能发出不同程度的绿色荧光，而细胞对照则未见荧光，说明鼠抗E1血清与SAV发生特异性反应(见图4)。

表1　间接ELISA检测SAV E1蛋白结果

图4　鼠抗E1血清与SAV的间接免疫荧光试验(100×)

3讨论

近年来鲑科鱼类养殖业迅猛发展，各养殖区之间贸易频繁，SAV感染鲑科鱼类引起鲑鱼胰腺病和晕睡病已经扩散至欧洲各国家[14-16]，给鲑鳟的养殖业带来巨大的经济损失。我国目前尚未发现此病的发生，为防止该病传入我国，建立 SAV 的快速、灵敏、特异的检测方法，对防范外来水生动物疫病的传入工作的开展尤为重要。

建立特异灵敏的检测方法，首先需要制备高效的检测试剂。E1蛋白是SAV的结构蛋白，大小为461个氨基酸，为跨膜糖蛋白暴露于病毒粒子表面。各基因型之间E1蛋白98%以上的氨基酸保守，其中436～1137 bp这段基因在各亚型之间100%保守，且没有糖基化位点[17]。因此，选择SAV各基因型E1蛋白(436～1137 bp)基因进行原核表达，制备的检测试剂可以检测已发现六个基因型的SAV。

以纯化的SAV病毒作为检测试剂，存在操作繁锁、稳定性差、产量低、成本高和生物安全隐患等方面问题[18]。原核表达系统作为成熟的操作系统，具有成本低、表达量高、操作简单、稳定性好等优点，被广泛应用于诊断试剂制备、蛋白功能研究和亚单位疫苗的生产等方面[19]。

本研究将SAV E1 436～1137 bp这段高保守基因pCold TF表达载体连接并构建重组表达系统，获得的重组pCold TF-E1蛋白作为免疫原免疫小鼠，制备抗血清。重组pCold TF-E1蛋白以可溶形式存在，且具有较好的反应性，利于后期采用亲和层析法纯化目的蛋白，在实际应用中可缩短生产时间，降低成本。通过间接免疫荧光实验表明，鼠抗E1蛋白血清可与SAV发生特异反应，表明制备的可溶重组E1蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。这为E1高保守区蛋白作为SAV的检测试剂及检测SAV方法的建立提供了理论依据。

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(责任编辑：张潇峮)

收稿日期：2015-05-19；

修订日期：2016-03-25

第一作者简介：蒋烨(1988-)，男，硕士研究生，专业方向为水产动物医学。E-mail:356916269@qq.com 通讯作者：刘敏。E-mail:liumin-707@163.com

中图分类号：S941.41

文献标识码：A

文章编号：1000-6907-(2016)04-0049-05

Prokaryotic expression and analysis of a recombinant fusion protein of highly conserved region of salmonid alphavirus E1 gene

JIANG Ye1,DU Hang1,TANG Li-jie2,QIAO Xin-yuan2,WANG Li2,GUAN Xue-ting1,JIANG Yan-ping2,CUI Wen2,LI Yi-jing2,LIU Min1

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China;2.CollegeofVeterinaryMedicine,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)

Abstract：Highly conservative sequence of salmonid alphavirus E1 gene (702 bp) was synthesized according to sequences of E1 gene of SAV1,SAV2 and SAV3 published in GenBank.It was cloned into prokaryotic expression vector pCold TF to construct recombinant plasmid.The recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21 cells.The expression of recombinant plasmid pCold TF in E.coli BL21 was induced using IPTG at 1.0 mmol/L.The target protein of 95 kD was obtained and confirmed by SDS-PAGE and Western blot.The recombinant protein was purified by nickelionaffinity chromatography,and antiserum was produced.Indirect ElISA showed the antiserum against E1protein had OD values at least twice that obtained for the negative control serum at a dilution of 1∶25 600.IFA showed the antiserum against E1 protein reacted specifically with SAV.The results indicated that the recombinant E1 protein was immunogenical and antigenical,which established a foundation for further study on detection method of SAV.

Key words：salmonid alphavirus,highly conserved E1 protein,prokaryotic expression,immunogenicity

资助项目：国家科技支撑计划(2013BAD12B02)