铁皮石斛共生萌发真菌对其种子萌发的影响

施海芳，董志渊，石 瑶，胡明举，丛 琨，杨丽英，袁理春，王家金，石亚娜*

（1.云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650223；2.云南农业大学农学与生物技术学院，云南 昆明 650000）

铁皮石斛（Dendrobium officinale）为兰科石斛属多年生附生草本植物，为中国传统名贵中药材，具有滋阴清热、益胃生津、增强免疫力等多种功效[1]。铁皮石斛种子正常状态下细小，没有胚乳，只有分化不完全的原胚。在自然条件下，种子胚中的营养不足以支持种子的萌发，必须与特定的真菌建立共生关系[2-4]，共生萌发获得的植株不仅比非共生萌发获得的植株生长速度快、成活率高，而且抗病性和抗逆性都得到了很大的改善[4]。

兰科的共生菌类群主要有担子菌门（Basidiomycota）的蜡壳耳目（Sebacinales）、胶膜菌科（Tulasnellaceae）和角担菌科（Ceratobasidiaceae）等，目前已有记录的石斛属植物的共生真菌大部分是属胶膜菌类真菌[5]。杨建文等[6]在胶膜菌属真菌S7对铁皮石斛种子萌发的影响研究中发现，胶膜菌属共生真菌不仅能提高铁皮石斛种子的发芽率，也提高了铁皮石斛幼苗在移栽后的抗病性和成活率。一般兰科种子播种后先在暗处或弱光处培养若干天再转至光下培养，部分兰科种子在黑暗条件下可以促进种子萌发。有研究显示大部分兰科种子在无光照的条件下可以萌发[7]。然而光照条件对铁皮石斛与共生真菌共生萌发的影响未有研究。铁皮石斛是中国比较珍贵的物种之一，也是名贵的传统中药材，但存在野生繁殖困难，在自然条件下必须与特定的真菌建立共生关系才能萌发的问题。通过对铁皮石斛种子与胶膜菌属真菌是否建立共生萌发关系以及共生萌发过程中光照的影响进行研究，进一步验证共生真菌对铁皮石斛种子萌发速率的影响，为铁皮石斛共生培养真菌的材料选择提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

胶膜菌属（Tulasnella）真菌分离自经人工授粉培育的铁皮石斛根部，试验菌株来自云南省农业科学院药用植物研究所。铁皮石斛种子也来自云南省农业科学院药用植物研究所。

1.2 培养基

共生培养基（Oatmeal agar，OMA）[8]：燕麦 4 g·L-1+琼脂 8 g·L-1，pH 值 5.6～5.8，灭菌备用。

菌株活化培养基（Potato dextrose agar，PDA）[9]：土豆 200 g·L-1+葡萄糖 20 g·L-1+琼脂 17 g·L-1，用于共生萌发真菌的增殖培养。

1.3 铁皮石斛种子悬浮液的制备

将铁皮石斛种子放入直径为6 cm的定性滤纸中，置于1%次氯酸钠溶液中消毒15～20 min，无菌水冲洗3～4次，每次5 min。将消毒完成的铁皮石斛种子洗脱到EP试管中，根据需求加入无菌水制成一定体积的种子悬浮液。

1.4 接种过程及对照试验

选取培养皿中长势较好的真菌，用无菌解剖刀切成面积为1 cm×1 cm的菌块，置于共生培养基中进行培养。

吸取1 mL种子悬浮液（约100粒左右的种子），均匀地播种在菌块周围的共生培养基上进行共生培养，以不接菌处理为对照（CK），每组重复3次。

1.5 培养条件及观察记录方式

封口密封后的培养瓶置于人工气候培养箱中，培养箱的气候条件分别为光照12 h·d-1和0 h·d-1，光照强度为2000 Lx，恒温（23±1）℃，RH 65%～70%。播种后每隔10 d观察并记录。参照Stewart&Zettler的方法用0～4个阶段对种子的萌发和幼苗的生长发育进行分级描述[10]，以培养皿中一半的种子完成每一阶段所需要的时间为记录结果。

2 结果与分析

2.1 铁皮石斛与胶膜菌属真菌共生萌发

试验条件下培养皿中一半的共生萌发种子（约50粒左右）完成第1阶段所需时间为10 d；培养皿中一半的共生萌发种子（约50粒左右）完成第2阶段，即种皮破裂所需时间平均为20 d；培养皿中一半的共生萌发种子（约50粒左右）完成第3阶段，即分化出原生分生组织所需时间平均为30 d；培养皿中一半的共生萌发种子（约50粒左右）完成第4阶段，即长出第1片叶并继续生长，进入幼苗发育初期的平均天数为40 d。相较于空白对照，每个阶段所需要的时间均减少10 d左右（表1和图1）。

表1 铁皮石斛共生萌发结果

图1 种子共生萌发培养情况

在同样的试验条件下，非共生萌发的铁皮石斛种子在萌发各阶段种子颜色较浅，生长势相对弱；有共生萌发真菌参与的共生萌发的种子各时期与幼苗颜色正常，生长势相对较强。

2.2 光照对共生萌发的影响

在培养期内，黑暗条件下的铁皮石斛种子未观察到萌发迹象。而在共生培养条件下，种子萌发率为83.91%。

3 讨论

在自然界中，兰科种子萌发必须要与适合共生真菌建立一定的共生关系[11]。共生萌发的优势大于非共生萌发，非共生萌发的幼苗在移栽到野外后也会与共生真菌建立一定的共生性[12-13]。另外，共生萌发形成的球茎和幼苗建立的兰科种群也比直接播种到野外萌发生长建立的兰科种群更优越[14]。部分兰科植物的共生萌发真菌具有专一性，本次试验以胶膜菌属的一种真菌（分离自人工授粉的铁皮石斛根部）为试验材料，通过试验发现，其与铁皮石斛的共生萌发作用效果显著，关于萌发后的生长状况，以及萌发阶段的专一性需进行深入研究[15]。