不同消毒剂对苹果幼叶愈伤组织形成的影响

邓金祥，杨光柱，马 钧，郑丽萍，李 帆，黄文静*

（1.会泽县纸厂乡农业技术推广站，云南会泽654200；2.云南省农业科学院园艺作物研究所，云南昆明650205）

植物组织培养技术是20世纪30年代初期利用植物细胞全能性发展起来的一项生物技术，到目前为止，该技术已经在植物生理学、植物病理学、作物遗传育种、生物化学、植物脱毒苗培育、无性系快速繁殖、种质资源低温保存以及加快育种进程等各个研究领域发挥着重要的基础作用，为珍稀濒危植物的优良品种快速繁育、脱病毒、突变筛选、次生代谢产物的工厂化生产、种质资源库建设和基因库建立等方面开辟了新途径，已经成为现代生物技术中重要的基础技术和研究手段之一[1-3]。但植物组培期间污染问题一直是国内外研究和探讨的主要问题之一。

目前植物组织培养过程中常用的消毒剂主要有漂白粉、过氧化氢、酒精、新洁尔灭、次氯酸钠、升汞、吐温，但这些消毒剂都具有对植物外植体的毒副作用，对环境也具有一定危害。本试验采用不同消毒剂，在消毒时间、培养条件相同的情况下，研究不同消毒剂对苹果幼嫩叶片的消毒效果的影响，进而诱导苹果幼嫩叶片获得高质量愈伤组织，为进一步开展育种研究、建立快繁体系等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料取自云南省昆明市云南省农业科学院园艺作物研究所实验基地。选取秋季生长旺盛、健壮、无病虫害的红富士幼嫩叶片作为外植体进行消毒效果比较实验。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的处理

将幼嫩叶片用洗洁精清洗干净，流水冲洗5 min。

1.2.2 不同消毒剂及消毒浓度

配 制75%酒 精、10% NaClO2、吐 温-80、0.1%HgCl2、50 mg·L-1纳米银植物外植体消毒剂备用。

1.2.3 不同消毒剂的处理

在超净工作台上，叶片统一用75%酒精消毒30 s，无菌水清洗3遍。试验设置3个处理：处理1，10% NaClO2+1滴吐温-80处理8 min；处理2，0.1%HgCl2处理8 min；处理3，50 mg·L-1纳米银组培专用消毒剂（重庆新位点生物科技有限公司）暗处理8 min[4]。灭菌时手工摇晃，以达到更好的灭菌效果。处理后，无菌水清洗4～5次，第1次清洗1 min。

1.3 培养条件

处理后的叶片用无菌纸吸干多余水分，切割成1 cm2左右小块，接种于MS+2，4-D 2.5 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1+维生素C 2 g·L-1叶片诱导愈伤组织培养基中，每瓶放置10片，每组10瓶，3次重复，放置于25℃，光照1000～1200 Lx，光照4 h·d-1。

从培养第2 d起，每隔5 d调查1次，总共调查8次。

1.4 统计与分析

采用Excel 2017统计污染率、褐化率、存活率、并按照下式计算：

污染率（%）=（污染数/接种总数）×100褐化率（%）=（褐化数/接种总数）×100

存活率（%）=[（接种总数-污染数-褐化数）/接种总数]×100

2 结果与分析

由表1可知，处理1从叶片培养的第12 d开始，污染率基本保持不变，褐化率、存活率在第22 d开始基本保持稳定，叶片开始膨大，形成愈伤组织小细胞团。处理2污染率在第7 d达到12.5%，后续保持不变，但褐化率持续增高，存活率持续降低，最终只达到11.9%。处理3在叶片培养的第12 d，污染率、褐化率、存活率基本保持稳定，叶片边缘没有出现愈伤组织小细胞团。

由表2可知，处理2消毒效果最好，但对幼叶伤害最严重，存活率最低，仅为11.9%；培养第37 d，存活的叶片膨大，周边出现愈伤组织小细胞团。处理3消毒效果不理想，污染率为32.5%，褐化率中等，存活率中等，为22.3%；培养第37 d，叶片无膨大，没有出现愈伤组织小细胞团。处理1污染率中等，对幼叶伤害最小，褐化率为20.5%，存活率最高达50.7%；培养第37 d，叶片膨大，出现愈伤组织小细胞团。综合考虑，污染率、褐化率、存活率、有无愈伤组织细胞团形成，本实验最适宜的消毒处理方法为10% NaClO2+1滴吐温-80消毒8 min。

表1 不同消毒剂处理叶片生长情况

表2 不用消毒剂对苹果嫩叶消毒效果

3 讨论与结论

木本植物组织培养中较困难的是获得无菌材料[4]，外植体消毒是否成功，不但关系到能否获得无菌材料，也是苹果组培快繁体系建立的关键之一。研究表明，不同消毒剂对外植体消毒效果不同，考虑到消毒剂对植物外植体的毒害程度、对环境的影响程度，本实验采用了已在生物医学方面应用广泛的纳米银消毒剂进行植物外植体消毒，与常用的10% NaClO2+1滴吐温-80和0.1% HgCl2进行对比，在消毒时间、培养条件相同的情况下，对比了3种消毒剂的消毒效果及愈伤组织诱导情况，发现0.1% HgCl2消毒效果最好，对叶片损害最小。愈伤组织诱导效果最好的是10% NaClO2+1滴吐温-80。50 mg·L-1纳米银消毒效果居中，且价格较高，消毒需要在暗环境下进行操作，且存活的叶片并未诱导出愈伤组织。所以，10%NaClO2+1滴吐温-80消毒仍然是苹果叶片诱导愈伤组织较理想的消毒剂。