时间:2024-05-25
杜金霞 申婷婷 王浩然 林一萍 李慧玉 张连飞
(1. 长春职业技术学院现代农学院,长春 130000;2. 黑龙江省庆安国有林场管理局,哈尔滨 150000;3. 东北林业大学,哈尔滨 150000)
SPL基因是植物特异性转录因子[1]。SPL家族基因的共同特征是包括1 个高度保守的76 个氨基酸残基SBP结构域。该结构域包含DNA结合所必需的2 个锌结合位点和C 末端的核定位信号(NLS)[1-2]。SPL基因首先在金鱼草(Antirrhinummajus)中被鉴定,能够与花分生组织识别基因SQUAMOSA启动子结合[1]。此后,SPL基因在绿藻、苔藓以及拟南芥(Arabidopsis thaliana)、葡萄(Vitis vinifera)、苹果(Malus pumila)和毛果杨(Populus trichocarpa)等其他物种[3-6]中陆续被发现。随着研究的深入,SPL基因的功能也逐渐明晰,研究发现SPL基因的表达水平受miR156/157的调控,在植物生长和生理的各个方面发挥着关键作用,包括植物胚胎[7]、叶原基形成[8]、组织和营养相的变化[9]、光信号的转导、次生代谢[10]和胁迫反应[11]。抑制AtSPL3的表达会导致拟南芥提前开花[9]。At-SPL3/4/5通过调节关键下游基因AtAP1、AtFUL和AtLFY的表达,参与花分生组织的发育[12]。Os-SPL16通过增加细胞分裂和籽粒灌浆,有效地提高稻米品质和产量,说明该基因对水稻(Oryza sativa)籽粒发育具有积极的影响[13]。OsSPL14抑制水稻分蘖数量,但促进穗分枝以增加粒质量[14]。在拟南芥中,SPL9干扰MYB-bHLH-WD40 转录复合体形成,抑制DFR的表达,从而抑制花青素的合成[10]。在低温下(5 ℃),葡萄VvSBP3和VvSBP5均上调,但VvSBP4和VvSBP7下调,表明VvSBP3和VvSBP5与葡萄的低温反应相关[15]。人们对拟南芥和水稻中SPL基因的功能了解很多,但对白桦(Betula platyphylla)中SPL基因的了解有限。
EAR 型转录抑制子是植物特有的一类转录抑制子,在激活子C 末端附加一段EAR 基序,形成融合蛋白,可将其转变为一个高效的负调控子,该技术被称为嵌合抑制子沉默技术(CREST)。CREST 在研究转录因子家族基因功能中应用广泛,其最大优点是可以克服基因冗余性的影响。迄今为止,对SPL基因的功能分析在木本植物中研究较少,尤其是白桦。根据第九次森林清查结果,白桦是我国蓄积量第二的树种,也是天然次生林更替的先锋树种。在前期研究中,通过白桦转录组及白桦基因组序列比对,共获得了12 条SPL基因,系统进化分析发现SPL家族分6 个亚类,其中SPL9属于第Ⅲ类,这一类基因除含有SBP 结构域外,基因长度差异较小[5]。本研究采用CREST 技术构建BpSPL9-EAR 的植物表达载体,遗传转化后,对获得的转基因白桦株系进行表型分析,探讨BpSPL9基因对白桦生长发育的影响,为进一步阐明白桦SPL9基因的生物学功能提供参考。
根据白桦SPL9基因序列[5],设计特异引物SPL9-F(5′-CACCATGAAAATGGGTTCGGGTTC-3′ ) 、SPL9-R (5′-TCAAGCGAAACCCAAACGGAGTTCTAGATCCAGATCCAGAAGTGACCAGTGCATCT -GC-3′),该引物用于克隆SPL9基因的不含终止密码子的ORF 序列,并在3′端加上编码12 个核苷酸的EAR 基因序列[16-17]。采用RNA 提取试剂盒(购自百泰克生物技术有限公司)提取白桦叶片总RNA,反转录为cDNA(购自北京全式金生物),稀释后为模板,PCR 扩增反应体系:2.0 μL 10×KOD Buffer、2.0 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs、SPL9-F和SPL9-R 引物各0.6 μL,2.0 μL cDNA、0.3 μL KOD Plus Neo,DNAfree 水补足到20.0 μL。反应程序:94 ℃2 min后,94 ℃45 s,58 ℃45 s,72 ℃1 min,35个循环后72 ℃7 min。目的片段经琼脂糖凝胶电泳检测后进行回收纯化。
纯化后的PCR 产物通过TOPO 反应连接到入门载体pENTR(pENTRTM/D-TOPO Cloning Kit,Invitrogen)上,转化大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞,挑取单克隆进行PCR 检测,将阳性菌落送至北京擎科生物科技有限公司进行测序分析。提取测序分析正确的阳性单克隆质粒,进行LR 反应,将SPL9-EAR 重组至pGWB2 载体上。将重组质粒pGWB2-BpSPL9-EAR 转化EHA105 感受态细胞(购自擎科生物有限公司),在LB+50 mg·L-1卡那霉素+50 mg·L-1利福平的固体培养基上进行筛选,PCR 检测为阳性的单克隆作为侵染白桦用的工程菌。
通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的白桦合子胚转化法进行白桦的遗传转化[18]。为检测目的基因是否成功导入到白桦中,分别以潮霉素抗性白桦株系及非转基因对照白桦株系(WT)的总DNA为模板,SPL9-F和SPL9-R为引物,pGWB2-BpSPL9 质粒和WT 的DNA 分别为阳性和阴性对照,同时设水对照,进行PCR扩增。
将BpSPL9-EAR 转基因白桦及对照白桦组培扩繁,生根后移栽到相同基质(V(黑土)∶V(草炭土)∶V(蛭石)=2∶2∶1)中,放到在植物培养室中培养,培养条件:室温25 ℃,16 h光照,8 h黑暗。2个月后测定苗高、地径、节间距及叶面积。选择Bp-SPL9-EAR 转基因白桦株系和WT 株系内长势一致、健康的各10株,分别取第7和8片叶,扫描仪扫描后用ImageJ 软件分析叶面积。各株系的苗高、地径及叶面积数据用SPSS 进行多重比较和方差分析。
取以上株系内长势一致、无病虫害的植株嫩叶,多株混合后采用酶联免疫法(购自中国农业大学)测定植物内源激素,每个样品测3次。
以白桦叶片cDNA 为模板,根据BpSPL9ORF序列设计含有12 个氨基酸的EAR 的特异引物,经PCR 获得BpSPL9-ERA 片段,电泳检测结果显示:在1 176 bp处获得特异条带,并与目标条带大小一致(见图1)。纯化后的PCR 产物经TOPO 反应后,其中3 个单克隆PCR 检测为阳性,选取电泳条带亮度最高的2个单克隆进行测序分析,测序结果证明已成功克隆BpSPL9,并成功构建到了pENTR 载体上(见图2)。提取经PCR 及测序检测为阳性克隆的质粒进行LR 反应(见图3),挑取的9 个单克隆进行PCR 检测,其中6 个PCR 检测为阳性,说明已成功构建pGWB2-BpSPL9-EAR载体。
图1 BpSPL9-EAR片段PCR产物电泳图谱M.Marker DL2000;1.水对照;2.BpSPL9基因Fig.1 Electrophoresis of PCR product of BpSPL9-EAR fragment M.Marker DL2000;1.Water control;2.BpSPL9 Genes
图2 pGWB2-BpSPL9-EAR载体图谱及PCR检测M.Marker DL2000;1.水对照;2~7.重组子Fig.2 Vector of pGWB2-BpSPL9-EAR M.Marker DL2000;1.Water control;2-7.Recombination element
图3 pGWB2-BpSPL9-EAR载体PCR检测M.Marker DL2000;1.阳性对照;2.水对照;3~11.大肠杆菌转化子Fig.3 Vector of pGWB2-BpSPL9-EAR M.Marker DL2000;1.Positive control;2.Water control;3-11.Escherichia coli invertor
将构建好pGWB2-BpSPL9-EAR 载体转化到EHA105后,以白桦合子胚为外植体进行侵染。将侵染后的白桦合子胚在Woody Plant medium(WPM)+1.0 mg·L-1细胞分裂素(6-BA)+0.2 mg·L-1萘乙酸(NAA)上共培养2 d后,转至WPM+0.8 mg·L-16-BA+0.02 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-1赤 霉 素(GA3)+50 mg·L-1潮霉素上,并在选择培养后加入头孢霉素抑制农杆菌生长,20 d 左右在切口处长出愈伤;待愈伤组织长到5 cm 左右,将其切下进行再分化培养,最终获得4 个抗性株系,分别命名为Bp-SPL9-SRDX-1~BpSPL9-SRDX-4。
分别以4 个转BpSPL9白桦株系及WT 叶片DNA 为模板,进行PCR 扩增验证外源基因是否已进入白桦基因组中(见图4),电泳结果显示:4个转化子均能够检测与阳性对照大小一致的目的条带,而WT 中没有检测出条带,说明BpSPL9-EAR已成功整合到白桦基因组中。
图4 转BpSPL9基因植株的PCR检测M.Marker DL2000;1.pGWB2-BpSPL9-EAR 质粒;2.水;3.WT;4~7.转化子Fig.4 PCR of BpSPL9 transgenic lines M.Marker DL2000;1.pGWB2-BpSPL9-EAR plasmids;2.Water;3.WT;4-7.Transformants
2.3.1 BpSPL9基因调控白桦的苗高和地径生长
对转基因及对照株系进行组培扩繁后移栽,2个月后测量苗高及地径,结果表明:除SPLSRDX-4外,其他3个转基因株系苗高与非转基因白桦差异均达到极显著水平(P<0.05),转基因株系的苗高显著低于WT 白桦(P<0.05),其中SPLSRDX-2 和SPLSRDX-3 株系的苗高分别比WT 低30.34%和25.86%。转基因株系地径与WT 差异不显著(P>0.05)(见图5)。
图5 BpSPL9-SRDX白桦株系的苗高及地径Fig.5 Analysis of seedling height and diameter of transgenic BpSPL9-SRDX lines
2.3.2 BpSPL9基因影响白桦节间距
对移栽2个月的转基因和WT株系节间距进行测定,结果显示:WT节间距主要分布在10~14 mm,而转基因白桦的节间距变短,多数分布在8~14 mm,尤其是SPLSRDX-1株系,在6~8 mm 也有较多分布(见图6)。表明BpSPL9影响白桦的节间距。
图6 转BpSPL9-SRDX株系的节间距分布Fig.6 Node spacing distribution of transgenic BpSPL9-SRDX lines
2.3.3 转基因株系的叶面积变小
对转基因白桦与WT的第7和8片叶的叶面积进行分析,结果表明:转基因和WT 株系的叶面积达到极显著水平(P<0.01),BpSPL9-SRDX-1 和Bp-SPL9-SRDX-4 的第7 片叶叶面积分别低于WT 叶面积的42.87%和38.96%,BpSPL9-SRDX-1 和Bp-SPL9-SRDX-2 的第8 片叶面积分别低于WT 的50.91%和47.82%(见图7)。
图7 转BpSPL9抑制表达株系的叶面积Fig.7 Analysis of leaf area of transgenic BpSPL9-SRDX lines
选取苗高最低的2 个转基因株系BpSPL9-SRDX-2 和BpSPL-SRDX-3 与WT,测定吲哚-3-乙酸(IAA)和6-苄氨基嘌呤(6-BA)的变化情况,株系内多株混样并做3次平行重复试验,结果表明:各株系间6-BA和IAA含量差异显著(P<0.05),转基因株系2 种激素含量均低于对照株系,尤其是BpSPL9-SRDX-2株系的IAA含量明显低于WT(见图8)。
图8 转基因株系的激素质量分数Fig.8 Hormone content of transgenic lines
大多数的SPL转录因子具有相似的表达模式,有研究表明,SPL转录因子存在于许多植物中,主要参与调控植物的花、叶、胁迫等过程。在麻风树(Jatropha curcas)中JcSPLs具有多样的时空表达模式,JcSPL3在7 或10 年生麻风树所有组织中的表达水平最高,并且随着树龄的增长呈现出增加的趋势,这表明它在麻风树年龄发育的调节中起着重要作用[18]。所有的拟南芥AtSPLs基因都在花分生组织和花器官(萼片、花瓣、雄蕊和心皮)及茎、叶、根等营养器官中表达[3]。结合转录组和qRT-PCR 分析的结果,发现大多数小麦TaSPL基因调控花序和穗发育。在十字花科(Brassicaceae)植物花和茎发育过程中,BjuSPL3a_B、BjuSPL2b_B和BjuSPL2c_A在花中显著表达,而BjuSPL3b_B和BjuSPL10a_A在茎节中显著表达[19],说明这2 个SPL可能参与茎节发育过程。前期研究发现,白桦SPL9基因在叶、芽、茎、雄花和雌花中均有表达[5],初步证明SPL9可能参与这几个组织部位的发育过程。
为了进一步揭示SPL9的功能,构建了Bp-SPL9-ERA 载体,转化白桦后观测转基因株系的表型。转BpSPL9抑制表达白桦表现出的苗高降低,节间距变短及叶面积变小的表型。
在拟南芥中过量表达AtSPL9和AtSPL10都可以延长叶片的间隔期,并降低叶片生成速率,导致叶片数量减少,叶面积增大[20]。种子萌发阶段,At-SPL13基因上调表达,叶原基发育受到抑制,进而影响了第1 片叶的形成。AtSPL9基因还在叶片形状和表皮毛的形成起作用[21-23]。BpSPL9同样影响白桦叶片大小,但对表皮毛的影响不明显。在陆地棉(Gossypium hirsutum)GhSPL3和GhSPL18过表达拟南芥植株的表型观测表明,这2个基因参与了叶片和第2芽的发育。SPL可能通过抑制YUC2和YUC6的转录来调节生长素的内环境稳定,并参与侧器官包括叶片的形态发生[24]。小麦(Triticum aestivum)TaSPL8基因敲除突变体叶片接合处缺失,叶片直立,结构紧凑,穗数增加,TaSPL8与生长素反应因子基因和油菜素类固醇生物发生基因CYP90D2的启动子结合并激活其表达[25]。BpSPL9的下调表达同样引起了白桦的节间距变短。在玉米(Zea mays)和水稻中,SPL家族成员UB3通过调节参与细胞分裂素生物合成和信号传导的LOG1和ARRs的表达,调节营养和生殖分支[26]。在白桦中,BpSPL9抑制表达株系生长素和细胞分裂素含量减低,苗木表现出苗高、节间距和叶片大小的变化该性状与AtSPL9和AtSPL10相似,说明SPL基因调控叶片发育方面在木本与草本植物中相对保守。推测BpSPL9可能通过影响生长素和细胞分裂素的合成,从而调控白桦的生长发育。后续还需要进一步分析该转录因子在白桦生长发育中的调控机制。
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