拟南芥种皮色素形成突变体的筛选与表型鉴定

李 娜 王潇楠

（1. 郑州澍青医学高等专科学校基础医学部，郑州 450000；2. 开封市蔬菜科学研究所，开封 475003）

种子是被子植物的生殖器官［1］，种皮包被着由卵子形成的胚和胚乳。种皮的重要功能包括保护胚远离生物和非生物胁迫，在胚的发育过程中为胚提供营养，在种子萌发时提供水和氧气，通过控制休眠来延迟种子的萌发等［2］。

种皮的颜色除作为形态指示性状外，也常与植物品质、脂肪酸含量等有关，目前利用模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）［3］开展种皮色素形成调控机理的研究已取得一定成果。拟南芥的种皮颜色主要由类黄酮的合成和积累决定，正常情况种子成熟和干燥阶段种皮褐变是由黄酮类化合物，特别是原花青素的氧化引起的［4］。编码和调控类黄酮生物合成中的某个酶或者蛋白质基因突变，植物体内类黄酮的积累量发生改变或者合成类黄酮的种类不同引起种皮颜色改变。研究表明类黄酮的生物合成主要受两类基因的控制，一类是编码生物合成途径中所需的一些酶类的结构基因，另一类是编码一些转录因子调控结构基因时空表达的调控基因［5］。这两类基因的突变，都会导致原花青素的合成和积累异常。在植物中，类黄酮除了提供鲜艳的花朵、水果、种子和叶片的色素外，在植物和微生物的信号传递［6］、一些物种的雄性可育［7］、调节活性氧水平［8］，抑制生长素运输［9］，防御作用［10］，信号共生有机体［11］和抵御UV 光伤害［12-13］过程中起关键性作用。越来越多的证据表明植物通过抗氧化剂黄酮类化合物积累，调节植物激素或活性氧（ROS）水平，间接提高植物非生物胁迫下抗性［14-15］。拟南芥透明种皮突变体在影响类黄酮合成的酶促步骤或转录调控中受损，在种皮颜色发生变化的同时也可能会影响其他生理表型的改变。拟南芥种皮颜色发生改变会导致种皮的厚度和质量、种子的萌发率、植株对重力和生长素的应答，以及对盐和干旱的抗性发生相应的变化［16-17］。因此研究类黄酮合成缺失突变体中影响植物其他结构性状的调控基因可为其他植物的检测提供有用的分子靶点。本研究筛选1 个透明种皮突变体，详细分析该突变体的表型，并鉴定导致tt4-1突变体突变的基因，为进一步研究基因功能奠定了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料和试剂

拟南芥野生型，包括columbia（Col-0）和Landsberg erecta（Ler）生态型；拟南芥Col-0 背景突变体tt4-1（突变体库实验室创制保存）。限制性内切酶和Marker 购自TaKaRa 公司；KOD-Plus DNA 聚合酶购自TOYOBO 公司；普通TaqDNA 聚合酶由本实验室自制；设计引物使用Primer Premier 5.0 软件，引物合成和测序由上海宝生生物技术有限公司完成。大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101、pBI121 和pCAMBIA1391载体由本实验室保存。

1.1.2 植物培养和植株杂交

拟南芥播种与培养：干燥拟南芥种子加入0.1%升汞进行表面消毒5～6 min，用灭过菌的双蒸水冲洗5～7 次。在超净工作台内，将表面消毒过的种子用尖头滴管播种在含0.6%琼脂的MS 固体培养基上，无菌封口后于冰箱中4 ℃春化3 d；再移至温室（光/暗为16 h/8 h，光照温度22 ℃，黑暗温度18 ℃；光照强度150 μmol·m-2·s-1；相对湿度80%左右）培养。

拟南芥植株培养：选取生长状态一致的拟南芥幼苗（生长至4片嫩叶时）从培养基中移栽至配置好的混合土（V（营养土）∶V（黑土）∶V（蛭石）=2∶1∶1）中，在培养室（光/暗16 h/8 h，光照温度22 ℃，黑暗温度18 ℃；光照强度120 μmol·m-2·s-1；相对湿度80%左右）培养。

拟南芥植株杂交：选新开放且花药较多的花朵做父本，用杂交专用镊子剥去萼片及花瓣部分；选未露白的花蕾做母本，保护好柱头，剥去除柱头外的所有部分。将处理好的父本的花药涂抹在去雄的母本柱头上，完成杂交并做标记，然后去除母本其他花粉干扰，将授粉柱头套袋处理，24 h 后取下袋子。

1.1.3 植物遗传转化

利用pTT4-pCAMBIA1391 载体转化农杆菌GV3101 感受态细胞，挑取阳性农杆菌单菌落扩大培养至OD600为1.2～1.6。拟南芥幼苗花序长至5～10 cm 高时，将花序浸没在菌液中，每株浸花30 s，将浸花过的苗盆以塑料膜覆盖保持湿度，避光放置16～24 h 后取出，正常培养5～7 d 后，重复浸染1次。

1.2 方法

1.2.1 透明种皮突变体的筛选

用化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）诱变Col-0野生型拟南芥种子，得到透明种皮突变体，种植自交繁殖，筛选得到突变体tt4-1（正常WT 的种子颜色为褐色）。将突变体与Col-0 野生型回交，F1代种下去收获F2代，将F2代种子点于含0.6%琼脂的MS 培养基中，培养2～3 d 根据下胚轴和子叶交界位置表现为黄色（野生型的则为褐色）的标准筛选突变体的纯合体。

1.2.2 图位克隆

1.2.2.1 突变体图位克隆

以突变体tt4-1作为母本，拟南芥生态型Ler作为父本，两者杂交获得F1代种子，鉴定杂交成功的F1代植株，自交得到F2代，在F2代群体中选择与突变体tt4-1表型一致的分离群体作为图位克隆作图群体。提取筛选植株的叶片DNA，利用已经公布拟南芥5 条染色体的25 个SSLP 标记为引物进行PCR 扩增，通过统计每对引物的重组率，判断突变位点所在的染色体区间，进行粗定位；确定突变位点所在染色体区间及其连锁的侧翼分子标记后，扩大作图群体，设计新分子标记进行精细定位。按下面公式计算重组率：

重组率/%=（单交换个体总数量+2×双交换个体总数量/2×样品总数量）×100% （1）

1.2.2.2 DNA的提取及PCR检测

采用文献［18］方法提取拟南芥tt4-1突变体、突变体与Ler 野生型杂交鉴定的F2代植株叶片的基因组DNA。10 μL PCR 扩增体系为5.0 μL 2×TaqMaster Mix（5 U·μL-1），引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，模板DNA1.0 μL，ddH2O 补至10 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，34 个循环；72 ℃延伸10 min，扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳，EB 染色，BIORAD凝胶成像系统观察照相。

1.2.3 构建互补表达载体

构建TT4pro-TT4pBI121 的表达载体，将载体质粒转化到根癌农杆菌中，利用农杆菌介导的花序侵染法［19］浸染tt4-1突变体，收获侵染后成熟的拟南芥种子，筛选纯合的转基因株系。

1.2.4 TT4基因在组织器官表达

将TT4的启动子片段与GUS 报告基因的编码区融合，构建pTT4-pCAMBIA1391 载体，采用农杆菌介导的花序侵染法［19］获得野生型拟南芥转化TT4-GUS 的转基因植株，将筛选的阳性幼苗移栽到MS 基质中培养。将采集植株的器官组织（根、茎、叶和花等）浸没于GUS 染液中，避光条件下，37 ℃水浴染色4～5 h，然后依次用50%乙醇、75%乙醇、无水乙醇进行脱色，直至叶绿素全部被脱去，观察并照相。

1.2.5 突变体表型统计方法

1.2.5.1 种子大小比较

取同一时间收获的颗粒饱满的突变体tt4-1和WT 种子，分别取100 粒，用电子天平称量种子的质量，统计每粒种子的长度和宽度。每种材料分别取3份进行测量。

1.2.5.2 生长周期表型观察

种皮颜色和叶片颜色通过体视镜观察；抽薹时间从春化结束到第1朵花朵脱落果荚可见为止；果荚的长度通过Image J 软件统计获得，在拟南芥果荚成熟时期，取10 个左右位于主轴中部分段的果荚，放置在带有标尺的空白纸上拍照记录，最后用Image J软件逐个测量果荚长度。

1.2.5.3 萌发率的比较

将同批次收获籽粒饱满的突变体种子tt4-1和WT 种子用升汞洗过之后，4 ℃春化3 d，点到含0.6%琼脂的MS 培养基中，放到光照材料室培养。从第2 天开始连续6 d 对萌发情况进行统计，直至全部萌发为止（每次3个重复，进行3次试验）。

1.2.5.4 根发育表型分析

将突变体tt4-1和WT 的种子点种到0.8% MS培养基上，平板放在培养室竖直培养，使其根部能够贴着培养基竖直生长。待根长至1 cm 左右时，挑选大小一致的苗整齐地分别摆放到含0.8%、1.0%、1.2%的琼脂培养基中竖直培养，1 周后用体式显微镜观察结果，记录侧根数量。

1.2.5.5 叶片表面温度的远红外成像和失水率测定方法

取在土中生长良好的、大小比较一致的3～4周的拟南芥幼苗（取苗的时间一般为中午12：00左右），迅速从土中连根取出幼苗，将WT和突变体整齐地摆放到同一张干净的纸上，用普通相机照相；然后放到远红外仪器中，观察拍照。将上述生长期幼苗从土中取出，剪掉根，放在干净的称量纸上，放到电子天平上称量，计数。前30 min 每5 min 称量一次，之后每隔30 min 称量1 次。直到每次的称量结果变化不明显时停止称量，记录数据。

1.2.5.6 数据处理

用SPSS 24.0 进行数据收集、处理；采用t检验等差分析方法进行试验组与对照组的显著性差异分析（*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001）。

2 结果与分析

2.1 透明种皮突变体获得

按1.2.1 方法筛选突变体纯合体，观察发现未成熟的突变体种子为绿色，WT 的为黄色；成熟的突变体的种子颜色为黄色，种皮薄而透明，WT 的为褐色（见图1）。经过多次繁殖和表型验证发现，黄种种皮表型能够稳定遗传。

图1 WT与突变体tt4-1成熟种子颜色Fig.1 Comparison of mature seed color between WT and mutant tt4-1

2.2 图位克隆

2.2.1 突变体遗传分析

通过突变体与Col-0 野生型回交的方法，得到回交F1代进行表型验证，发现回交F1代的表型和Col-0 野生型一样，说明tt4-1突变是隐性突变。突变体和WT 杂交，对子代表型分离比进行统计，褐色种皮与透明种皮数量比例接近于3∶1，表明该突变基因为单基因隐性突变。

2.2.2 突变体粗细定位结果

按1.2.1 方法筛选1 800 植株作为基因定位的群体，按照1.2.2.1 和1.2.2.2 方法进行图位克隆。表1～2分别是突变基因粗、细定位的结果。

表1 突变基因的粗定位结果Table 1 The primary mapping results of the mutant gene

2.2.3 突变基因测序结果

在MAH20的BAC上挑选了一些基因并进行测序。结果如图2A 所示，突变体tt4-1在At5G13930基因的DNA 序列的第1 299 位发生了碱基C 突变为碱基T，导致TT4基因在第324位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸（见图2B）。构建TT4pro-TT4pBI121的表达载体，利用农杆菌介导的花序侵染法浸染tt4-1，收获浸染后成熟的拟南芥种子，筛选纯合的转基因株系，互补实验验证恢复褐色种皮的表型（图2C）。以上试验证明tt4-1突变体透明种皮的表型是由TT4基因突变所致。

表2 突变基因细定位结果Table 2 The fine positional mapping statistical results of the mutant gene

图2 突变基因测序结果及突变基因的鉴定A.测序序列比对结果（红色圆圈标注的即为发生突变的碱基）；B.AT5G13930 编码的正常氨基酸序列和发生突变的氨基酸（红色圆圈标注为正常的氨基酸，黑色箭头所指为发生改变的氨基酸，即甘氨酸（Gly，G）突变为谷氨酸（Glu，E）；C.WT，tt4-1突变体和pTT4：：TT4-GFP tt4-1基因回补种子颜色比较，突变基因确为TT4Fig.2 Sequencing results of mutant gene and identification of mutated gene A.The sequencing and results of blas（tWith the red circle that mutations for bases）；B.The sequence of normal amino acid and the mutations of amino acids of AT5G13930（With the red circle for normal amino acids，black arrow for the change of the amino acids），and Glycine（Gly，G）mutates to glutamate（Glu，E）；C.The Seed Coat Pigmentation of WT，tt4-1 and pTT4：：TT4-GFP tt4-1，and the mutated gene was indeed TT4

2.3 TT4基因的组织器官表达模式分析

为分析TT4在拟南芥不同时期、不同器官中的表达情况。将TT4的启动子片段与GUS 报告基因的编码区融合，构建pTT4-pCAMBIA1391 载体（见图3），获得野生型拟南芥转化TT4-GUS 的转基因植株，将筛选的阳性幼苗移栽到MS 基质中培养。GUS 染色结果如图4 所示。从图中可以看出，TT4基因在拟南芥幼苗根、茎、叶和花中均有表达。

图3 TT4组织表达载体构建A.TT4启动子序列图谱；B.pCAMBIA1391载体图谱；C～D.TT4启动子序列的pCAMBIA1391载体的构建及双酶切验证Fig.3 Construction of tissue expression vector of TT4 A.TT4 promoter sequence map；B.pCAMBIA1391 vector map；C-D.Construction of pCAMBIA1391 vector with TT4 promoter sequence and verification of double digestion

图4 TT4基因的组织表达定位情况A.拟南芥生长7 d 时转基因幼苗中TT4 基因的组织表达；B～F.子叶及茎（B）、根毛区（C）、根成熟区（D）、根尖及分生区（E）和花（F、G）中TT4基因的组织表达情况Fig.4 Expression pattern and Tissue and organ localization of TT4 gene A.Tissue expression of TT4 gene in transgenic seedlings of Arabidopsis thaliana grown for 7 d；B-F.Tissue expression of TT4 gene in cotyledon and stem（B），root hair zon（eC），root mature zon（eD），root tip and meristem（E）and flowe（rF，G）

2.4 突变体表型分析

2.4.1 种子大小比较

结果显示突变体的种子百粒质量和野生型相比显著降低（*P＜0.05），长度短且宽（见表3）。突变体的种子形状更接近于圆形，而WT的则为椭圆形（见图5）。

表3 WT与突变体tt4-1的种子大小及质量比较Table 3 Comparison of seed traits between WT and mutant tt4-1

图5 WT与突变体tt4-1的种子形状比较Fig.5 Comparison of seed shape between WT and mutant tt4-1

2.4.2 生长周期表型观察

在种植培养的过程中突变体tt4-1与WT 在整个生长周期中表现出许多不同的表型（见图6）。观察发现，tt4-1的叶片在生长过程中与WT相比稍微发黄，尤其是在前期，表现的比较明显；tt4-1抽薹的时间比WT 要提前1 周左右，种子成熟时间也随之提前；植株成熟之后，相对于WT 来说tt4-1的植株矮小，但分支比较多；成熟的突变体果荚短小，粗短，颜色稍微发黄。

图6 正常生长状态下WT与突变体tt4-1的表型比较A.土壤中生长3周的植株叶片；B.土壤中生长5周的拟南芥苗；C.成熟植株；D.未成熟果荚Fig.6 The phenotype analysis between WT and mutant tt4-1 under normal growth condition A.Three weeks of plant growth in the Soil；B.Five weeks of plant growth in the Soil；C.Mature plants；D.Immature fruit pod

2.4.3 萌发率的比较

对突变体tt4-1、WT 种子进行萌发率试验分析。结果表明突变体tt4-1比WT 萌发早，萌发率高且差异显著（见图7）。说明种皮颜色的改变可能影响种子的休眠和萌发期间对水分吸收。

图7 正常生长状态下WT与突变体tt4-1的萌发率Fig.7 The germination rate between WT and mutant tt4-1 under normal growth condition

2.4.4 根发育表型分析

观察生长期间tt4-1突变体根发育情况发现，与WT 相比，tt4-1突变体表现主根较短，侧根较多（见图8A）。增加琼脂浓度能部分抑制tt4-1突变体的侧根生长发育，侧根数目随培养基硬度增加而减少（见图8B）。

图8 MS培养基中WT与突变体tt4-1的侧根比较A.含0.8%琼脂的MS培养基中的根生长情况；B.琼脂浓度分别为0.6%、0.8%、1.0%、1.2%培养基培养的侧根数目统计分析Fig.8 Comparison of lateral roots between WT and mutant tt4-1 in MS medium A.The root growth in 0.8% MS culture；B.The number analysis of lateral root cultured in medium when agar concentrations were 0.6%，0.8%，1.0%and 1.2%respectively

2.4.5 突变体tt4-1 与WT 叶面温度和失水率的测定

通过远红外技术可以观察到突变体tt4-1的温度比WT的温度要低2～3 ℃，说明突变体比WT的气孔开度大（见图9A）。蒸腾作用会散失水分，使叶片表面的温度降低，气孔开度越大，水分散失越多，温度就越低。因此接着测定突变体和WT的叶片失水率，图9B结果显示突变体与野生型相比叶片失水率显著高，这和突变体叶面低温表型的结果一致。

图9 WT与突变体tt4-1的叶面温度和失水率的比较A.WT和tt4-1在土壤中生长2周叶片表面温度差；B.WT和tt4-1正常生长2周的叶片失水率统计分析Fig.9 Comparison of leaf temperature and Water loss rate between WT and mutant tt4-1 A.The difference of WT and tt4-1 on surface temperature of two weeks seedlings；B.Water loss rate analysis of WT and tt4-1 under normal growth condition

3 讨论

通过正向遗传学筛选突变体方法［20］获得种皮透明突变体tt4-1，利用图位克隆技术，将突变锁定在5号染色体的分子标记MAH20和它附近的一些BAC 上，通过对该区间内的基因进行筛选和测序，初步推测At5g13930基因突变。互补试验发现植物种皮恢复褐色，验证突变基因确为TT4基因。TT4基因（At5g13930）编码查尔酮合酶，催化4-香豆酰-Co（1 分子）和丙二酰-CoA（3 分子）缩合形成查尔酮（又称苯基苯乙烯酮，Chalcone），是类黄酮合成途径的第1步反应，也是类黄酮合成途径的重要限速酶［21］，因此TT4基因突变后类黄酮合成缺失引起拟南芥种皮色泽变黄。

类黄酮作为次级代谢产物参与植物抗氧化、生长发育以及响应生物和非生物胁迫等多种生理过程，编码查尔酮合酶的TT4基因突变导致类黄酮合成障碍，突变体tt4-1较野生型生理表型有所不同。与WT相比，tt4-1的种子萌发快且高。有研究［22］认为野生型抑制种子萌发可能并不是由于色素过量积累，而是因为原花青素多聚物被花青素代替，从而增加了植株对四唑盐的渗透作用。tt4-1突变体因为类黄酮合成缺失，推测突变体种子的萌发行为可能与种子对四唑盐有较强的渗透能力有关［23］。对种子萌发过程中的内源抑制剂（脱落酸）或外源刺激物（水或氧气）的强渗透性或许可以解释为什么tt4-1突变体的休眠期较短。突变体萌发率高的具体机制有待于下一步深入研究。tt4-1突变体的侧根和根毛较WT 多，这与Chapman等［24］用活性氧ROS 响应探针检查到类黄酮缺失突变体因ROS积累，增加侧根原基中山奈酚的水平，刺激侧根出苗的结果一致。Buer 等［16］研究发现类黄酮缺失突变体根部合成的黄酮产物减少，而生长素的极性运输却有所增加。因此推测TT4基因的突变改变类黄酮的生物合成和生长素的运输，tt4-1突变体根尖有向地性延迟，同时影响拟南芥根对重力和光的响应，出现主根少，侧根和根毛较野生型增多的现象。Nakabayashi等［14］研究认为拟南芥中自由基清除剂类黄酮可以减轻拟南芥的抗氧化和抵抗干旱胁迫。类黄酮合成障碍tt4-1突变体叶片气孔开度大，失水率高，抗胁迫能力差，推测其为了适应外界复杂环境，抽薹开花结果早，尽早繁衍后代有关［25］，这与我们观察到tt4-1突变体抽薹早，果荚小的表型一致。本研究首次克隆出TT4基因，鉴于其属于拟南芥类黄酮前期生物合成基因，试验检测TT4基因在植株幼苗、根、茎、叶和花器官中均有组织表达。下一步将构建TT4超表达载体深入研究此基因的功能和类黄酮缺失tt4-1突变体在各种胁迫条件下的调控机制。

作为类黄酮缺失突变体之一的tt4-1突变体的研究，不仅有助于揭示类黄酮在植物中重要作用，而且对TT4基因的功能研究具有重要的意义。本试验获得的tt4-1突变体为进一步研究TT4基因与种皮颜色调控的关系提供了新的遗传材料，也为深入研究此基因参与调控植物胁迫和种皮发育的可能机制奠定了理论基础。