麋鹿角柄发育规律与相关内分泌及信号通路检测

夏志强，单云芳，李俊芳，张庆勋，贺永惠，崔艳红，钟震宇，柏 超，张成林，白加德，孟庆辉

（1.北京市科学技术研究院北京麋鹿生态实验中心，北京，100076；2.河南科技学院动物科技学院，新乡，453003；3.圈养野生动物技术北京市重点实验室，北京动物园管理处，北京，100044）

有角动物存在于有蹄类反刍动物分支中，现存约80 个属，近300 个种，超过30 亿的个体［1］，其角可以分为骨质角和角质角2 个类群，鹿类是现存具骨质角的哺乳动物类群［2］。牛羊的角因内含骨质核［3］，终生不脱落，随年龄增长逐渐变粗大，幼龄阶段如因营养紧缺生长受限，待成年营养解除限制后，也无法代偿性恢复生长［4］；而鹿角则不同，会周期性全部脱落，留下骨柄［5］，并在1～2个月内实现完全再生，后期逐渐骨化和脱落茸皮，把骨质角裸露在外，作为性选择重要特征，参与繁殖争霸［6］。出生后雄鹿角柄的激活对于鹿角的生长极为重要［7］，鹿类角柄的青春期发育对于鹿的个性与等级序位形成［8］、鹿角大小［9］、争夺配偶［10］、种间竞争［11］及应对天敌［12］等有重要的意义。

麋鹿（Elaphurus davidianus）属季节性繁殖动物，作为其强大攻击和保护性武器的角，分枝向后与生境形成了完美匹配，成功占据了湿地生态位，导致其从演替出现直至灭绝都尚未走出湿地的死胡同窘境，成就了“成也麋鹿，败也麋鹿”局面［13］。经过近38年的保护努力，中国境内共有10 000余头麋鹿，重新恢复了野生种群，但是遗传多样性指数仍然较低，除大丰和石首2 种群超过1 000 头外，其他分布地麋鹿均在200 头以下且随时可能面临再次灭绝的风险，因此需要加强麋鹿保护界的居安思危和对麋鹿保护重启新的重视［14］。本研究利用红外测距仪，开展麋鹿角柄生长发育规律的宏观测量；对不同年龄组1岁、2岁和3岁的角柄骨膜组织取样，对信号通路表达和血液样品激素水平进行检测。角不仅可作为动物本身重要的性选择标志，对于人类医学也具有重要研究价值，针对麋鹿角柄骨膜发育的初步研究，以期为幼龄鹿类的饲养管理、鹿品种培育、茸再生、再生医学和中药材应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

1985 年从英国乌邦寺重引进的麋鹿，半散放于北京南海子，平均海拔9.6 m，年均气温13.1 ℃，年均降水量约600 mm，常年湿度30%～70%，年均日照时间5 000～6 200 h，无霜期（132.0±9.7）d［15］。麋鹿种群自由采食、饮水和繁衍，雄性麋鹿冬季解角。因受生态承载力限制，北京麋鹿种群常年维持在160～220头，每年出生幼子50头左右，其中雄性15～30头。

试验选取健康无病、体况优良、同父异母和出生日期（2018年4月5—25日）接近的雄性麋鹿，依出生时间佩戴耳标以阿拉伯数字编号。试验麋鹿饲养方案：每日09：00、15：30各投喂1次，自由饮水，符合北京麋鹿苑麋鹿四季饲养管理方案，粗料为主，精料为辅［15］。

试验分2 组，分别是角柄发育前、角柄发育后两阶段，其中角柄发育后阶段又分为首次生茸前（12月1—22 日）和生茸期（12 月23 日—翌年3 月15 日）。血样采集于2020 年1 月—2022 年12 月，每月第1 周周一上午，其中2020 年29 份，2021 年27 份，2022 年 20份，共76份。

1.2 研究方法

1.2.1 角柄发育与骨膜取样

每日饲喂的同时观察和测量幼龄麋鹿角柄发育及生茸状况。对不同发育阶段的角柄拍照，记录角柄发育过程和生茸过程中顶端伤口愈合、分枝时间。角脱落后记录编号，切取鹿角基部第1 片横切片（厚1 mm），称其质量［15］。2020、2021和2022年分别于生茸前和生茸期进行角柄皮下骨膜组织采样，软尺测量茸长度，记录左、右侧茸发育情况。组织取样后立刻送回实验室，分别浸泡在甲醛液中固定，-80 ℃冷冻保存。

1.2.2 血液激素水平检测

采用上海酶联生物科技有限公司的酶联免疫试剂盒测定血清中的激素含量，提前将试剂盒从冷藏环境中取出，室温平衡1～2 h。（1）加样：标准孔加不同浓度的标准品50 μL；待测样品孔中先加稀释液40 μL，再向孔底部加入血清样品10 μL，轻晃均匀。（2）加酶：除空白孔外，每孔加入100 μL。（3）温育：封板，干燥箱中37 ℃温育60 min。（4）配液：洗涤液稀释后备用。（5）洗涤：每孔加满洗涤液，静置30 s 后弃去，重复5次。（6）显色：加入显色液A 50 μL，显色液B 50 μL，混匀后置于37 ℃避光显色15 min。（7）终止：加终止液50 μL 终止反应。（8）测定：450 nm 波长测量各孔的吸光度（OD 值）。绘制标准曲线，计算实际浓度。

1.2.3 信号通路检测

称取样品组织，利用Trizol 法提取组织RNA，并通过紫外分光光度计检测RNA 样品浓度及纯度。根据反转录试剂盒对RNA 进行反转录，反转录结束后将样品稀释分装保存。参照NCBI 网站提供的马鹿基因序列，利用Primer Premier 5.0 软件设计所需引物，所有引物均由北京擎科创新生物科技有限公司合成，具体引物序列见表1。

表1 RT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequence of RT-PCR

1.2.4 数据处理

试验结果均符合正态分布，齐次性检验中，若方差齐时选择LSD 法检验各个水平间存在的差异；若方差不齐时选择Tamhane’s T2 检验总体方差不等的两组之间的差异，通过使用ANOVA 分析及LSD多重比较来分析不同激素的年度变化及判断不 同激素与角柄及茸再生的相关性差异。显著性水平α＜0.05。

2 结果

2.1 角柄发育

初生仔鹿额部未表现隆凸，仅有左右对称的逆序毛旋，旋毛稍长、色深；雄性麋鹿在第1 年秋季开始出生后的角柄发育，由毛旋处长出骨质突起，逐渐形成初角基，是茸角生长的基础；翌年2—3 月角柄长度2.5～3.0 cm，初角茸不分枝，与成年麋鹿不同，5—6月陆续开始首次生茸，冬至脱落，形成完整的角柄。经初角茸后，角柄继续发育，直至体成熟，角柄骨膜不断地持续增殖，在此期间，鹿角每年发生周期性脱落，翌年茸再生变大分枝增多；角柄逐渐变粗变短，至完全成熟（图1）。

图1 幼龄阶段雄性麋鹿角柄发育Fig.1 Antler pedicle development in young male Père David’s deer

亚成体麋鹿角脱落与再生期角柄的发育，也主要经历生茸初期、快速生长期及生茸后期等阶段。（1）生茸初期，脱角形成的碗状伤口1～2 d 结痂，伤口周围“皮肤环”增殖变厚，是茸生长的基础［8］。生茸8～9 d 表面开始长出稀疏浅白色茸毛，中心伤口结痂也不断向内收缩变小，鹿茸主枝形成，生长速度逐渐加快。此阶段，角柄逐渐恢复营养供给，变粗大，骨芯代偿加快，皮肤和血管也开始活跃，代谢加速，为下一阶段茸快速生长做足准备。（2）快速生长期，茸主枝增长到一定长度后顶端出现2 个生长中心（生茸23～25 d），待眉枝完全出现（生茸30 d 左右），结痂脱落，伤口处完全愈合且不留疤痕，是皮肤再生能力的体现［9］。此时，角柄代谢达到 最旺盛状态，局部血液循坏加快，角柄秋季萎缩 造成的阻塞管道全部打通，营养供给达年度最高峰，角柄和茸生长最快。（3）生茸后期，鹿茸成型并逐渐停止增长（生茸70 d），鹿茸开始骨化变硬，茸皮逐渐脱落，最终形成坚硬鹿角。角柄也逐渐开始萎缩，血管封闭，钙磷代谢减慢，并有少部分矿物质回流（表2）。

表2 鹿茸生长阶段及角柄特征变化Tab.2 Characteristics of Père David’s deer antler and pedicle in different growth stages

随年龄增长角柄不断地变粗成熟，雄鹿由于每年生茸前，角柄内部钙质被吸收，脱落时带走了部分死亡的细胞和骨质，老年后角柄逐渐缩短，角基盘和生长面不断扩大和下移；解角后，创面逐年变大，封口时间逐年延长。

2.2 角柄发育参数

青春期角柄第2 次发育后，随年龄增长，逐渐变粗；老年后随脱落次数增多，角柄逐渐变短。角柄围长由2 岁时的（17.17±1.00）cm 增加到3 岁时的（35.43±0.83）cm，差异极显著（F1，9=4.128 1，n=9，p=0.005 3）；角柄直径由2 岁时的（3.66±0.59）cm 增加到3岁时的（5.91±0.72）cm，差异极显著（F1，9=3.174 0，n=9，p=0.024 6）；角横切面外径长由2 岁时的（10.30±1.25）mm增加到3岁时的（32.50±3.11）mm，差异极显著（F1，9=5.266 1，n=9，p=0.000 9）；角横切面外径宽由2 岁时的（7.60±0.83）mm 增加到3 岁 时的（27.50±1.84）mm，差异极显著（F1，9=4.820 3，n=9，p=0.001 5）（表3）。

表3 不同年龄段麋鹿角柄生长数据Tab.3 Growth data of Père David’s deer antler pedicle at different ages

2.3 血液激素水平

幼龄雄性麋鹿睾酮的分泌水平与角柄发育密切相关，生长素、IGF-1 与角柄发育也存在关联。睾酮分泌水平由1 岁时的（564.27±41.16）pg/mL 增加到3 岁时的（737.96±66.57）pg/mL，差异极显著（F1，9=4.303 0，n=9，p=0.002 2）；生长素分泌水平由1 岁 时的（3.10±0.32）ng/mL 增加到3 岁时的（6.60± 0.57）ng/mL，差异显著（F1，9=2.511 5，n=9，p=0.035 9）；IGF-1 分泌水平由1 岁时的（122.55±12.21）ng/mL增加到3 岁时的（169.13±33.18）ng/mL，差异显著（F1，9=2.773 0，n=9，p=0.020 1）（表4）。

表4 不同年龄段幼龄雄性麋鹿血液激素水平Tab.4 Blood hormone levels of young male Père David’s deer at different ages

2.4 信号通路表达水平

信号通路TGF-β/Smads 与幼龄麋鹿角柄骨膜发育有关。TGF-β1mRNA 相对表达水平由角柄萌发前的（1.07±0.04）增加到3 岁时的（4.47±1.14），差异极显著（F1，9=3.711 7，n=9，p=0.006 6）；TGF-β1RmRNA 相对表达水平由角柄萌发前的（0.96±0.07）增加到3 岁时的（2.01±0.34），差异极显著（F1，9=3.332 9，n=9，p=0.009 9）（表5）。

表5 幼龄麋鹿角柄组织mRNA相对表达情况Tab.5 mRNA relative expression in antler pedicle tissues of young male Père David’s deer

3 讨论

不同鹿科（Cervidae）动物因分布纬度不同，占据生态位不同，丘陵狍（Capreolus pygargus）、林缘梅花鹿（Cervus nippon）、高山森林马鹿（C.elaphus）和平原湿地麋鹿的鹿角脱落周期节律与繁殖期节律各异［16］。平原湿地麋鹿因生态位决定［13］需要在5 月底开始圈群、打斗、争夺配偶和繁殖［17］，所以须在严寒冬季，微调内分泌水平和相关因子表达水平，提前开始旧角脱落和新茸再生，使其在发情期到来之前形成坚实的硬角，参与竞争繁殖。而幼龄麋鹿与成年麋鹿不同［15］，出生后第2年5—6月开始首次生茸（出生后第2年2—3月角柄生长长度为2.5～3.0 cm，为初角基），冬至脱落，此时形成完整的角柄［18］。青春期麋鹿经初角茸后，角柄则继续发育，直至体成熟［19］，角柄骨膜不断地持续增殖，在此期间，鹿角每年发生周期性脱落，翌年茸再生变大在原来基础上分枝逐渐增多［8，20］，推测角柄骨膜细胞具有记忆功能。

本研究表明，青春期雄性麋鹿睾酮分泌水平与角柄发育密切相关（F1，9=4.303 0，n=9，p=0.002 2），生长素、IGF-1 与角柄发育存在关联，信号通路TGFβ/Smads 也参与了角柄骨膜的发育。TGF-β1 可能收到来自雄激素刺激的下游信号激活鹿茸角柄骨膜组织细胞膜上的受体，随后由Smad2、Smad3 将信号传递到角柄骨膜组织细胞核内并与Smad4 结合形成复合物，识别靶基因并调控转录因子的表达，最终完成信号的传递和角柄的增殖。结果显示，在角柄骨膜快速增殖的细胞分裂阶段，TGF-β/Smads通路十分活跃，说明TGF-β1 还能通过参与调节鹿茸骨膜细胞的细胞分裂周期，增加S 期细胞比例，并可能促进细胞周期的转换，参与骨膜细胞增殖。

角柄是鹿茸周期性再生的基础［21］。幼龄鹿类角柄发育及调控研究目前仍进展缓慢，本研究对麋鹿角柄发育及机制开展了初步研究，探讨了幼龄阶段雄性麋鹿激素发育水平的变化规律与相关分子表达情况，为持续开展麋鹿角柄发育、旧角脱落与新茸冬至再生多样化机制奠定了基础，对提高幼龄鹿类的管理与福利水平等有重要实际应用意义。

致谢：本研究是在北京麋鹿生态实验中心多位员工的参与下共同完成的，在此对所有参与人员表示感谢。