宁夏野生岩羊PPRV全基因组测定与系统进化分析

阚龙飞，孟宪踊，闫飞虎，李元果，王铁成，徐 钰，初 冬，王卫东，李岳城，赵永坤，高玉伟，冯 娜，夏咸柱

（1.吉林农业大学动物医学院，长春，130118；2.中国农业科学院长春兽医研究所，吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，长春，130122；3.国家林业和草原局生物灾害防控中心，沈阳，110034；4.宁夏回族自治区森林病虫防治检疫总站，银川，750001）

小反刍兽疫（peste des petits ruminants，PPR）是由副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒属（Morbillivirus）的小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus，PPRV）引起的一种急性、高度传染性和致死性疾病［1］；天然宿主为山羊和绵羊，此外还可能感染多种野生动物；临床症状包括发热、眼鼻有脓性黏液分泌物、坏死性和糜烂性口腔炎、胃肠炎、腹泻和支气管肺炎［2］。PPRV 为单股负链RNA 病毒，只有1 个血清型；基因组包含6 个基因，依次为3′-N-P-M-F-H-L-5′，对应编码6 种结构蛋白，分别为核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素蛋白（H）和大蛋白（L），此外P基因还编码2 种非结构蛋白C、V［3］。根据N或F基因序列系统进化分析，PPRV 可分为4 个谱系（Ⅰ～Ⅳ），其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ系主要流行于非洲，Ⅳ系主要流行于亚洲，我国流行的也是谱系Ⅳ［3-4］。

2007 年7 月，我国西藏阿里地区首次报道了PPR 疫情，同年在西藏革吉、日土、札达和改则4 县也出现了该疫情，并于2008 年6 月和2010 年5 月在西藏尼玛县和日土县两度暴发［5］。2013 年11 月，新疆伊犁出现PPR疫情，同年在新疆阿克苏、哈密和巴音郭楞相继出现PPR 疫情，并在2014 年上半年迅速蔓延至中国大部分地区，包括甘肃、内蒙古和宁夏等22 个省、直辖市和自治区［6］。随着小反刍兽疫强制免疫计划在全国的大范围实施，近年来我国家羊的PPR呈现零星散发状态。

PPRV除了在家畜中流行以外，在野生动物中也多次被发现，如2007—2008 年，西藏日土县和革吉县两地相继报道了野生岩羊（Pseudois nayaur）感染PPRV 病例［7］；2013—2016 年，新疆鄯善、博乐、乌鲁木齐、巴里坤和库车的野生北山羊（Capra ibex sibirica）、盘羊（Ovis ammon）和鹅喉羚（Gazella subgutturosa）种群中也曾出现过感染PPRV 病例［8］；2017—2018年，青海海北州刚察县、新疆阿克苏地区和甘肃省西部分别发现少量野生岩羊、野生北山羊和普氏原羚（Procapra przewalskii）死于PPRV 感染［9-11］；2021年1—2 月，青海省都兰县和西藏拉萨市两地分别发现34 只和58 只野生岩羊死于PPRV 感染［12］。这些野生动物中PPRV 的持续存在，不但威胁着包括濒危物种在内的多种野生动物生命安全，还会阻碍PPR 全球根除计划的完成。因此，除了要严格执行国家制定的小反刍兽疫强制免疫计划外，还应该继续监测野生动物中PPRV 的感染情况，以便及时采取有效的防控措施。

本研究对wild-bharal/China-NXYH/2021 株进行了全基因组测定和系统进化分析，旨在明确其所属的基因谱系以及与国内外PPRV 流行株的亲缘关系。研究结果可以为野生动物PPR流行病学特点和PPRV分子生物学特征提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病料样品

2021 年1 月，宁夏岩画发现1 只疑似被PPRV 感染的野生岩羊，该岩羊的脾、肺组织样品被置于干冰泡沫箱内运送至中国农业科学院长春兽医研究所。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

根据GenBank 公布的PPRV 基因组序列，设计13 对全基因组扩增引物（表1），由吉林省库美生物科技有限公司合成。

表1 13对PPRV全基因组扩增引物Tab.1 13 pairs of whole genome amplification primers for PPRV

1.2.2 病毒RNA提取和RT-PCR

将组织样品研磨后，4 ℃、9 000g，离心5 min，吸取适量上清按病毒RNA 提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）说明书提取总RNA。配制50 μL反转录体系：28 μL RNA，10 μL AMV Buffer（5×），4 μL AMV 反转录酶，5 μL dNTP（10 mmol/mL），1 μL Random primer（N9），1 μL Oligo（dT）primer，1 μL RRI（反转录所用试剂均购自TaKaRa 公司）。反应条件：30 ℃反应10 min，使Random primer（N9）达到足够长度；42 ℃反转录1 h；95 ℃反应5 min，灭活AMV 反转录酶。使用13对PPRV 全基因组扩增引物分别对反转录产物进行PCR，50 μL PCR 体系包含4 μL cDNA，25 μL 高保真酶2×Phanta Max Master Mix（Dye Plus）（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），上、下游引物各2 μL，17 μL RNase Free ddH2O。反应程序：95 ℃预变性3 min；35个循环（95 ℃变性15 s；退火温度见表1，退火15 s；72 ℃延伸时间=1 min/kb×（表1 中对应片段长度/1 000）kb=0.5～3.0 min）；72 ℃终延伸5 min。

1.2.3 全基因组序列测定和拼接

PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，按照Eastep凝胶及PCR 回收试剂盒（上海普洛麦格生物产品有限公司）说明书进行胶回收，回收产物送至吉林省库美生物科技有限公司测序，参考GenBank 公布的PPRV 基因组序列，使用DNASTAR Lasergene v7.1.0的SeqMan Pro软件拼接测序结果，最后获得该PPRV株全基因组序列，并将其命名为wild-bharal/China-NXYH/2021株。

1.2.4 系统进化分析和序列一致性分析

从GenBank 分别下载不同基因型、宿主、国家（地区）和时间的PPRV 参考株N基因和全基因组序列，随后将序列导入MEGA 7.0 软件中，各毒株按“宿主/国家（地区）/时间”格式命名（表2），使用ClustalW 方法进行多序列比对；通过maximum likelihood法建立系统进化树，Bootstrap method设为1 000次重复，Model/Method设为Kimura 2-parameter model。

表2 PPRV参考株信息Tab.2 Information on PPRV reference strains

打开DNASTAR Lasergene v7.1.0 的MegAlign软件，使用ClustalW 方法比对wild-bharal/China-NXYH/2021 株和PPRV 参考株的核苷酸序列或氨基酸序列，比对结束后点击View 菜单栏下的Sequence Distances。

2 结果

2.1 PCR扩增结果

提取的总RNA 经过RT-PCR、1%琼脂糖凝胶电泳（图1）和胶回收后，获得了13 个大小符合预期的基因片段。

图1 wild-bharal/China-NXYH/2021株PCR产物的电泳结果Fig.1 Electrophoresis results of PCR products of wild-bharal/China-NXYH/2021 strain

2.2 wild-bharal/China-NXYH/2021株全基因组序列分析

序列拼接结果显示，该毒株的基因组全长为 15 954 nt，与GenBank 公布的2013 年以来中国和2016—2017 年蒙古大部分PPRV 株全基因组长度一致，与全基因组长度为15 948 nt的2007—2008年西藏流行株和其他国外流行株的长度不同，多出6 nt。

通过全基因组序列比对，发现wild-bharal/China-NXYH/2021、goat/China-XJYL/2013、sheep/China-NX/2014、Ibex/China-XJBZ/2015、goat/Mongolia/2016、Saiga-tatarica/Mongolia/2017、Goitered-gazelle/Mongolia/2017 和Procapra-przewalskii/China-GS/2018 毒 株在5 217～5 222 位插入了6 个核苷酸（TCCCTC 或TCTCCC，图2中红色方框内）。

图2 全基因组序列比对结果Fig.2 Results of whole genome sequence alignment

2.3 wild-bharal/China-NXYH/2021株与参考株一致性比较

wild-bharal/China-NXYH/2021株与参考株的全基因组一致性为86.5%～99.4%，其中与goat/Burundi/2017株一致性最低（86.5%），与goat/China-XJYL/2013株一致性最高（99.4%）；与国内其他野生动物PPRV株wild-bharal/China-Tibet/2008、Ibex/China-XJBZ/2015和Procapra-przewalskii/China-GS/2018 的一致性分别为96.8%、98.8%和99.0%（图3）。

图3 全基因组一致性分析结果Fig.3 Whole genome identity analysis results

比较wild-bharal/China-NXYH/2021 株与国内野生动物PPRV 株、疫苗株（Nigeria 75/1 株和Sungri/96株）的基因及蛋白一致性可知，N、P、M、F、H和L基因一致性分别为93.2%～99.0%、92.6%～99.5%、93.4%～99.1%、92.6%～99.3%、91.2%～99.2% 和93.6%～99.3%；在氨基酸水平上，M蛋白保守性最高（97.3%～100.0%），P 蛋白保守性最低（90.2%～98.8%）；wild-bharal/China-NXYH/2021 株与2 个疫苗株Nigeria 75/1 和Sungri/96 的H 蛋白一致性分别为92.6%、97.0%，与F 蛋白一致性分别为96.2%、98.5%（表3）。

表3 wild-bharal/China-NXYH/2021株与国内野生动物PPRV株、疫苗株的基因及蛋白一致性Tab.3 Gene and protein identity between wild-bharal/China-NXYH/2021 strain and domestic wild animal PPRV strains and vaccine strains

2.4 wild-bharal/China-NXYH/2021 株H 和F 蛋白中氨基酸的多态性

与国内野生动物PPRV 株以及其他PPRV 参考株相比，wild-bharal/China-NXYH/2021株H、F蛋白中存在独特的氨基酸突变，分别为H 蛋白的R285Q、S421R和F蛋白的R/K/T3W、Q305R（表4）。

表4 wild-bharal/China-NXYH/2021株H和F蛋白中氨基酸的多态性Tab.4 Polymorphism of amino acids in H and F proteins of wild-bharal/China-NXYH/2021 strain

2.5 N基因和全基因组的系统进化分析

分别以wild-bharal/China-NXYH/2021株和PPRV参考株的N基因和全基因组序列为基础，建立系统进化树。系统进化分析结果显示，wild-bharal/China-NXYH/2021 株属于基因Ⅳ系，与2013 年以来中国流行株和2016—2017 年蒙古流行株亲缘关系较近，共同组成一个小的进化分支（图4，图5）。

图4 基于N基因的系统进化分析结果Fig.4 Results of phylogenetic analysis based on N gene

图5 基于全基因组的系统进化分析结果Fig.5 Whole genome phylogenetic analysis results

3 讨论

小反刍兽疫病毒分子遗传特征显示，wildbharal/China-NXYH/2021株F基因的5′UTR内5 217～5 222 位存在6 个核苷酸（TCCCTC）插入，这使基因组全长变为15 954 nt。这种因F基因5′UTR 内插入6 个核苷酸而改变基因组全长的特征，普遍存在于2013 年 以来中国和蒙古的PPRV 基因组中［13］。PPRVF基因5′UTR 可以通过提高翻译效率和mRNA 稳定性来增强F基因的翻译［14］，但此处插入 6个核苷酸对原有功能的影响目前尚不清楚，需要进一步研究。

wild-bharal/China-NXYH/2021 株与2 个疫苗株Nigeria 75/1、Sungri/96 的H 蛋白一致性分别为92.6%、97.0%，与F蛋白一致性分别为96.2%、98.5%。H 和F 蛋白是PPRV 主要的抗原蛋白，H 蛋白包含较多中和抗体表位和少数T 细胞表位，主要诱导中和抗体的表达，F 蛋白包含许多T 细胞表位，主要诱导特异性抗体表达［15］。有研究指出，商品化PPR 疫苗（Nigeria 75/1 株或Sungri/96 株）对4 种谱系的PPRV都可以提供完全的临床保护［16］。我国使用的是Nigeria 75/1 株弱毒活疫苗，经过多年坚持对家羊小反刍兽疫进行强制免疫，已经基本控制了家羊的PPR疫情，并完成了多个免疫无疫区建设。而对于野生动物小反刍兽疫的预防，目前尚无合适的商品化疫苗。因此，野生动物中小反刍兽疫流行情况的及时监测预警对PPR的防控仍然至关重要。

PPRV 的H 和F 蛋白还是决定细胞和宿主嗜性的关键性蛋白，H 蛋白分别与宿主免疫细胞和上皮细胞上的麻疹病毒受体SLAM 和nectin-4 结合，而F蛋白介导随后的膜融合，以便病毒进入细胞［13］。由H 和F 蛋白的氨基酸多态性分析可知，wild-bharal/China-NXYH/2021 株的H 和F 蛋白中存在独特的氨基酸突变，分别为H 蛋白的R285Q、S421R 和F 蛋白的R/K/T3W、Q305R。该毒株H和F蛋白中这些氨基酸的突变可能是为了更好地适应野生动物宿主。更多野生动物PPRV 株基因组数据的测定和进一步分析，有利于评估以上突变是否具有宿主物种特异性。

近年来，PPRV 感染野生动物事件曾被多次报道，其中2016—2017年蒙古东部PPRV感染事件后果最为严重，导致赛加羚羊（Saiga tatarica mongolica）、北山羊和鹅喉羚等野生动物死亡总数超过5 000只，使得赛加羚羊数量减少了80%［13，17］；2007—2021 年，在我国西藏、新疆、青海和甘肃等地野生岩羊、北山羊、盘羊、鹅喉羚和普氏原羚等种群中也曾出现过PPRV 感染致死的报道［7-12］。这些野生动物感染病例警示了PPRV 广泛存在于多种野生动物中。尽管目前国内报道的野生动物感染PPRV 的致死数量较少，但由于野生动物活动范围较大，发病后不易被发现，对其他野生动物和家养小反刍动物的生命安全可能构成潜在威胁。因此，加强野生动物小反刍兽疫流行情况的监测，全面掌握国内野生动物小反刍兽疫流行动态和病毒变异情况，对小反刍兽疫的防控具有重要意义，可为PPRV 的多宿主感染和溯源研究提供参考依据。