马鹿CDK8基因生物信息学分析与组织表达

唐成怡，吴玄烨，吴 尽，杨 帆，刘学东

（东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040）

CDK8 是细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（cyclindependent kinases，CDK）家族的一员［1］，参与转录调控［2］，并以中介体复合物和CDK8亚基复合物的形式参与调控NOTCH 信号通路［3］、Wnt/β-catenin 信号通路［3-5］。当下，关于CDK8的研究集中于肿瘤细胞中的功能及靶向CDK8的肿瘤抑制剂方面，对野生动物CDK8的研究相对较少。

鹿茸为雄性鹿科（Cervidae）动物未骨化而带茸毛的角，每年周期性地生长发育，然后脱落。鹿茸是迄今发现的唯一能够完全再生的哺乳动物器官，可被用作研究器官再生的生物学模型［6］。鹿茸生长由软骨内骨化所驱动，涉及软骨发育、骨化、血管生长和神经发育等生理过程。NOTCH 信号通路和Wnt/β-catenin 通路能促进鹿茸软骨细胞的增殖和分化［7］，在鹿茸软骨形成过程中扮演重要角色［8］。而CDK8 作为转录机器中介体复合物的重要组成部分，在鹿茸再生中的功能尚无研究。为研究CDK8 是否在马鹿（Cervus elaphus）鹿茸的再生发育中起作用，本研究克隆了马鹿CDK8基因编码区（coding sequence，CDS）序列，并进行生物信息学分析，同时利用实时荧光定量PCR 技术检测CDK8的mRNA 在马鹿鹿茸各组织中的表达差异，为了解鹿茸再生过程中CDK8 的作用机制与功能提供重要的基础数据，也为马鹿的遗传资源保护与利用提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2022 年7 月，在秦皇岛野生动物园采集雄性鹿茸，消毒杀菌去除表面茸毛后，将表皮层、间充质层、前软骨和软骨分离并剔除多余组织，切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 的小块，放入装有组织保存液的 1.5 mL离心管中，冰箱-80 ℃保存备用。

1.2 鹿茸总RNA的提取和cDNA的合成

将组织块取出称量，液氮研磨后按RNA 提取试剂盒（南京诺维赞生物科技股份有限公司）说明书提取RNA，并用NanoDrop One（赛默飞公司）测定提取RNA 的浓度及纯度，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA 的完整性。然后按照反转录试剂盒（南京诺维赞生物科技股份有限公司）说明书合成总cDNA，冰箱-20 ℃保存备用。

1.3 CDK8基因CDS区扩增和克隆

引物设计：参照GenBank上预测的马鹿CDK8基因（GenBankXM_043891847.1）序列和GAPDH基因（XM_043881239.1），在Primer Premier5 软件设计扩增CDS 区引物，在Primer3 input（https：//primer3.ut.ee/）在线设计qPCR 引物，送哈尔滨睿博兴科（东北）生物技术有限公司合成（表1）。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer sequence information

用PCR 仪扩增（型号SEDI G，威泰克（香港）有限公司），PCR 扩增体系为50 μL：2×RapidTaqMaster Mix（南京诺维赞生物科技股份有限公司）25 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 20 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性 15 s，54 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环；72 ℃终延伸5 min；产物4 ℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测（电泳仪型号Power-PacTMHV，Bio-Rad（美国）公司），回收扩增成功的目的条带，再次利用1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop One检测质量及浓度。

将纯化后的PCR 产物与pMD-18T 载体（宝生物工程（大连）有限公司）连接，连接体系10 μL：pMD-18T 载体1 μL，PCR 产物2 μL，ddH2O 2 μL，Solution Ⅰ 5 μL；16 ℃连接30 min。连接完成后取3 μL 产物与30 μL 大肠杆菌DH-5α感受态细胞（上海唯地生物技术有限公司）混合转化，涂布到含氨苄抗性的LB 固体培养基上，37 ℃恒温培养14 h，随后挑取阳性菌落于500 μL 含氨苄抗性的液体LB 培养基中摇菌培养，4 h后进行菌液PCR验证。

将验证成功的菌株扩大培养后送往哈尔滨睿博兴科（东北）生物技术有限公司进行双向测序，利用DNAStar 软件查看峰图，对序列拼接，并将序列翻译为氨基酸序列。

1.4 CDK8 基因生物信息学分析及系统进化树构建

将测序所获得的马鹿CDK8基因序列及翻译后的氨基酸序列与在NCBI 获得的家马（Equus caballus）、普氏野马（Equus przewalskii）、山羊（Capra hircus）、野猪（Sus scrofa）、小家鼠（Mus musculus）、川金丝猴（Rhinopithecus roxellana）、红原鸡（Gallus gallus）、艾草松鸡（Centrocercus urophasianus）、美国鲥鱼（Alosa sapidissima）、斑马鱼（Danio rerio）和人（Homo sapiens）的CDK8氨基酸序列比对，并利用SnapGene、MEGA 5.0 软件将以上氨基酸序列进行相似性分析和构建系统进化树。

利用ExPASy 服务器ProtScale 模块（https：//web.expasy.org/protscale/）对马鹿CDK8基因编码蛋白质进行疏水性预测，利用在线分析工具SignalP 4.1 Server（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-4.1）对CDK8 蛋白进行信号肽预测，运用在线分析工具DeepTMHMM（https：//dtu.biolib.com/DeepTMHMM）对CDK8 蛋白进行跨膜区预测分析，用NetPhos 3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1）进行磷酸化预测，再使用SOPMA 在线分析网站预测马鹿CDK8基因编码蛋白的二级结构（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_ automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html），并 用SWISS-MODEL 同源建模法（https：//swissmodel.expasy.org/）对马鹿CDK8基因编码蛋白质的三级结构进行预测。

1.5 CDK8基因实时荧光定量分析

以合成的表皮层、间充质层、前软骨和软骨组织的cDNA 稀释液为模板进行荧光定量PCR（荧光定量PCR 仪型号CFX96，Bio-Rad（美国）公司），测量CDK8在马鹿鹿茸不同组织内的表达量；以GAPDH为内参基因，使用2-ΔΔCt法计算CDK8在不同组织中的相对表达量，使用引物见表1，每个样本设置3 个重复孔。反应体系：模板4.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，2×TransStart Tip Green qPCR SuperMix（北京全式金生物技术股份有限公司）10.0 μL，ddH2O 5.2 μL，总体系为20.0 μL。反应程序：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共40 个循环。为验 证引物的特异性，设置熔解曲线程序：95 ℃变性 10 s，由65 ℃升温到95 ℃，每5 s 上升0.5 ℃并读板1次。

2 结果

2.1 马鹿CDK8基因CDS区克隆

以马鹿鹿茸茸皮组织cDNA 为模板扩增CDK8基因CDS 区，电泳后获得约1 300 bp 的特异性条带（图1），与预期结果一致。条带回收后与pMD-18T载体连接并转化，选取菌液PCR阳性样品送测序，将测序结果与不同物种的CDK8及马鹿CDK8基因 各转录本比对，测序结果与人、鼠和羊等物种的CDK8高度相似，与马鹿CDK8的预测转录本4 完全一致，证明马鹿中确实存在转录本4 且被克隆成功。

图1 马鹿CDK8基因CDS区PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification result of CDK8 gene CDS region in red deer

2.2 马鹿CDK8蛋白的生物信息学分析

2.2.1 序列同源性比对与进化树分析

马鹿、普氏野马、山羊、人、小家鼠、红原鸡和斑马鱼等物种的CDK8 蛋白序列比对结果显示：该蛋白在哺乳类、鸟类间的相似性高达98%以上，在哺乳类、鸟类和鱼类间的相似性达93%以上（图2）；进化树结果也显示CDK8 在各物种间进化保守（图3），说明该蛋白在各物种内的功能及作用机制相对保守。

图2 不同种属的CDK8蛋白相似性Fig.2 Comparison of CDK8 protein similarities among different species

图3 不同种属CDK8蛋白的系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree ofCDK8 protein among different species

2.2.2 CDK8蛋白质分析

理化性质：CDK8分子式为C2125H3286N588O631S18，用ProtParam 分析该蛋白序列，马鹿的CDK8基因CDS全长为1 254 bp，共编码417 个氨基酸，含量最多 的为亮氨酸（7.9%）；相对分子质量为47 744.11，理论等电点（pI）为7.28，带正电荷的氨基酸残基数（Arg+Lys）和带负电荷的氨基酸残基数（Asp+Glu）均为55。亲水性平均值为-0.759，为亲水性蛋白，脂肪系数66.19，不稳定系数40.12，是不稳定蛋白。

亲疏水性与跨膜区域：采用在线分析工具ProtScale 中Hphob./Kyte &Doolittle 算 法，以19 为 1 个阅读框（大于1.6 的区域为疏水区，小于-1.6 的区域为亲水区，1.6～-1.6 的区域为两性区域），对蛋白质的亲疏水性进行分析（图4A），最大值为1.268，最小值为-3.037，且亲水区域大于疏水区域，与Prot-Param 预测结果一致，属亲水性蛋白，无跨膜区域。用DeepTMHMM 对该蛋白进行分析，预测结果显示无跨膜区域，与ProtScale预测结果一致。

图4 马鹿CDK8蛋白的生物信息学分析Fig.4 Bioinformatics analysis of red deer CDK8 protein

信号肽与亚细胞定位：SignalP 4.0 分析预测结果显示CDK8 蛋白质不具有信号肽（图4B）。用WoLF PSORT 工具预测CDK8蛋白的亚细胞定位，分数分别为细胞核17.00，细胞核和细胞质15.67，细胞质12.00，线粒体7.70，说明CDK8 蛋白可能定位在细胞核中。

磷酸化位点：用NetPhos 3.1 预测CDK8 蛋白的氨基酸磷酸化位点，用NetOGlyc 4.0 程序预测糖基化位点。结果表明，CDK8 蛋白有38 个可能的磷酸化位点（图4C），分别为4 个酪氨酸（Tyr）、16 个苏氨酸（Thr）和18 个丝氨酸（Ser）；CDK8 蛋白具有25 个可能的糖基化位点。

蛋白质二级结构预测：用在线软件SOPMA 对CDK8 蛋白质的二级结构进行预测分析，CDK8 蛋白主要以无规则蜷曲为主，占53.96%，其次为α-螺旋和延伸链，分别占29.98%、12.47%，最少的是β转角，占3.60%（图4D）。

蛋白质三级结构预测：用在线分析软件ExPASy中的SWISS-MODEL Work space 程序预测马鹿CDK8蛋白质的三级结构（图4E），相似性达99.72%，GMQE 为0.72（取值为0～1，值越大可信度越大），以无规则蜷曲和α螺旋为主，结构较松散，可能与其在复合物中的支架作用有关。

2.3 CDK8 基因在马鹿鹿茸各组织中的相对表达量

利用RT-PCR 技术检测CDK8基因在马鹿鹿茸各组织中的表达水平，以GAPDH为内参基因，用2-ΔΔCt法分析，结果如图5 所示。经t检验和单因素方差分析，发现CDK8在马鹿鹿茸各组织间的mRNA表达水平差异显著（P＜0.000 1）。4种组织中，CDK8在茸皮中表达量最高，其后依次是间充质和软骨，前软骨中CDK8表达水平最低。以前软骨为对照组，表达量为（1.00±0.03），茸皮、间充质和软骨的相对表达量依次是（4.22±0.38）、（2.71±0.21）和（1.94±0.25）。

图5 马鹿CDK8在鹿茸各组织中的表达差异Fig.5 mRNA relative expression of CDK8 gene in different tissues of red deer antler

3 讨论

本研究成功克隆了马鹿CDK8基因CDS 区序列，该序列长1 254 bp，共编码417 个氨基酸。同源性分析发现，该基因编码蛋白在马鹿、山羊、家马、普氏野马和红原鸡等物种间的相似性高达98%以上，在哺乳类、鸟类和鱼类间达93%以上，说明CDK8在物种间保守性较高，生理功能作用机制相似，该基因在不同物种间的研究结果有较高的参考意义。

对马鹿CDK8 蛋白理化性质进行生物信息学预测分析，结果显示CDK8分子式为C2125H3286N588O631S18，相对分子质量为47 744.11，理论等电点为7.28，是亲水性、无信号肽和无跨膜结构的不稳定蛋白，有 38 个可能的磷酸化位点。磷酸化、乙酰化和甲基化等蛋白的翻译后修饰可以调节蛋白的激活、灭活和降解。已有研究用蛋白质组学方法找出8 个CDK8蛋白的磷酸化位点，但不同位点的修饰对CDK8 功能的调节作用还有待研究［9-10］。CDK8 二级及三级结构预测结果显示，该蛋白有大量的无规则卷曲和α螺旋，三级结构与很多蛋白相比较松散，这可能与该蛋白的功能有关。CDK8 可作为支架结合Med12、Med13 和周期蛋白C（cyclin C）形成CDK8 亚基复合物，以独立于中介体复合物的形式行使组蛋白激酶的功能［11］。

马鹿鹿茸不同组织中，茸皮和间充质层的CDK8表达量最高，CDK8可能在茸皮和间充质组织中起到促进细胞增殖的作用。马鹿鹿茸中茸皮与间充质在最外层，生长最快，细胞增殖和分化也快。CDK8在很多癌症细胞中被认为是原癌基因，有促进细胞增殖、迁移和侵袭的作用。在乳腺癌中，CDK8在乳腺癌细胞中过表达，用miR-26b 抑制CDK8的表达，可以抑制癌细胞的增殖，并使人乳腺癌细胞系MDAMB-231、MCF-7 周期停止［12］。但在子宫内膜癌中，CDK8表现为抑癌基因，在内源CDK8低表达的KLE细胞中使CDK8过表达，在体内小鼠模型中，抑制细胞增殖，有效阻断肿瘤生长，并在体外试验Transwell中抑制细胞迁移；而在内源CDK8高表达的AN3 CA和HEC-1A 细胞系中敲除CDK8结果则恰好相反［13］。在包括卵巢癌在内的多种癌细胞模型中，CDK8还能驱动上皮到间充质的转化。CDK8可通过招募YAP1控制对TGF-β/BMP 骨形态发生蛋白敏感的SMAD 转录激活和周转，SMAD1在广泛的癌症模型中以严重依赖于基质刚度和YAP1 的方式驱动上皮到间充质的转化（EMT）［14］。在胰腺癌中，突变的K-ras激活CDK8，部分CDK8通过Wnt/β-catenin 信号通路刺激胰腺癌的上皮-间充质转化［15］。

CDK8在鹿茸前软骨中的表达量比软骨高，比茸皮和间充质低，可能与CDK8调节软骨分化，维持骨细胞稳态作用相关。研究人员在用TGF-β诱导梅花鹿（Cervus nippon）、塔里木马鹿（C.elaphus yarkandensis）鹿茸间充质干细胞向软骨分化过程中，检测到多个Wnt家族基因表达量增加，初步说明Wnt 通路对软骨及软骨骨化有重要的影响［16-17］。除大量研究证明CDK8可调控Wnt 通路外，小鼠遗传研究表明，骨髓间充质干细胞中的CDK8通过CDK8-RANKL-STAT1轴控制破骨细胞形成，在骨吸收和体内平衡中起着至关重要的作用［18］。所以推测CDK8可能参与鹿茸的生长发育，本研究结果也表明，鹿茸不同组织间的CDK8的mRNA 表达水平有差异。下一步可通过在鹿茸间充质细胞中过表达/敲减CDK8，进一步研究与软骨及骨化有关的CDK8下游基因。

相比于CDK8调控下游基因的研究，CDK8上游基因研究较少，对调控CDK8上游因子研究多集中于miRNA，在一些肿瘤细胞试验中略有提及CDK8的调控通路，在乳腺癌细胞中Skp2 与CDK8 与肿瘤状态呈正相关，与mH2A1呈负相关。Skp2可泛素化mH2A1，敲低Skp2 使mH2A1 上调、CDK8 下调，肿瘤增殖减小［19］。目前以CDK8 为靶点的肿瘤治疗方式引起高度关注，但多以化学类CDK8 抑制剂为主，仅有极少数抑制剂进入临床研究。研究CDK8的作用及调控机制在鹿茸生长发育、肿瘤发生发展与抑制方面都有重大意义，后续可就CDK8对马鹿不同组织细胞增殖、分化的具体作用做深入研究。