5个芍药属伊藤杂种的倍性鉴定及核型分析

杨柳慧 张建军 王 琪 朱 炜 张 滕 于晓南*

(1.北京林业大学园林学院，北京 100083； 2.花卉种质资源创新与分子育种北京重点实验室，北京 100083； 3.国家花卉工程技术研究中心，北京 100083)

5个芍药属伊藤杂种的倍性鉴定及核型分析

杨柳慧1,2,3张建军1,2,3王 琪1,2,3朱 炜1,2,3张 滕1,2,3于晓南1,2,3*

(1.北京林业大学园林学院，北京 100083；2.花卉种质资源创新与分子育种北京重点实验室，北京 100083；3.国家花卉工程技术研究中心，北京 100083)

采用常规压片法，对5个芍药属伊藤杂种进行了核型分析。结果表明：5个芍药属伊藤杂种的品种均为三倍体(2n=3x=15)，核型不对称系数为61.02%～62.41%，核型类型均属于2A型，所有品种的核型均由中部(m)、近中部(sm)和近端部(st)的着丝粒染色体组成。本研究首次摸清了芍药属伊藤杂种的核型背景，为品种改良提供了细胞学资料。

伊藤杂种；三倍体；核型参数

芍药科(Paeoniaceae)芍药属(PaeoniaL.)的植物由3个组组成，牡丹组(Sect.Moutan)、芍药组(Sect.Paeonia)和北美芍药组(Sect.Oneapia)[1～4]。芍药与牡丹的组间杂交获得的品种，被称为伊藤杂种(Itoh hybrid)，其是以芍药为母本、牡丹为父本获得的极为珍贵的组间远缘杂种。伊藤杂种与传统芍药品种相比，具有极强的杂种优势，具备茎杆挺拔、花头直立、花色奇特、抗逆性更强等特点，被育种家称为“神赐的礼物”[5～7]。

牡丹组所有种的染色体数目均为二倍体(2n=2x=10),染色体核型主要有三种类型，即2n=2x=10=6m+2sm+2st、2n=2x=10=8m+2st和2n=2x=10=8m+2sm[8～11]，仅在栽培品种中发现了三倍体(2n=3x=15),染色体核型为2n=3x=15=12m+3st[12]。芍药组内存在倍性的分化，芍药(P.lactiflora)、川赤芍(P.veitchii)、块根芍药(P.anomala)等为二倍体(2n=2x=10),荷兰芍药(P.officinalis)、大叶芍药(P.macrophylla)和欧洲芍药(P.peregrina)等为四倍体(2n=4x=20)[13～15]；洪德元[16]、杨涤清和朱燮桴[17]、Lepper[18]、丁开宇和刘鸣远[19]等分别对各地区的美丽芍药(P.mairei)和草芍药(P.obovata)等展开了研究，发现它们存在二倍体(2n=2x=10)和四倍体(2n=4x=20)的分化；李煜照和徐晋麟[20]对3个中国芍药品种群的栽培品种的研究发现均为二倍体；马慧[21]报道了2个三倍体品种的核型；王士泉[15]研究提出芍药组染色体核型为2n=2x=10=6m+2sm+2st或2n=4x=20=12m+4sm+4st。

组间杂交获得的伊藤杂种起源复杂，目前市场上流行的品种基本为20世纪60～80年代由Toichi Itoh、Holingsworth、Anderson、Chris Laning等育种爱好者育成，其亲本资料无法获取。染色体核型研究对于亲缘关系鉴定、品种筛选、杂交组合选配等方面具有十分重要的意义。本文对5个伊藤杂种进行染色体倍性鉴定和核型分析，为后续的品种改良工作提供细胞学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为本课题组2013年从美国俄勒冈州波特兰市引进的5份伊藤杂种(表1)，种植于北京林业大学国家花卉工程技术研究中心小汤山栽培基地。

1.2 试验方法

2016年3～4月，选择晴朗无风天气，上午9:00～11:00，选择生长健壮的植株，用镊子选取新长出的白色根尖约1 cm，取下后置于放线菌酮中(6～8 h)，转入卡诺固定液24 h(4℃)，转入70%乙醇保存备用(4℃)。

制片时，用蒸馏水漂洗预先处理的根尖分生区，在1 mol·L-1盐酸溶液中(60℃水浴)，解离10 min；再次用蒸馏水漂洗；改良苯酚品红染色5～10 min，常规方法压片，ZEISS Scope A1显微镜镜检并统计染色体数目、显微观察并拍摄。

1.3 数据处理

采用Karyo 3.1和Photoshop CS5软件进行数据采集和图片处理。选择30个染色体分散良好且处于有丝分裂中期的细胞进行统计，85%以上的细胞具有恒定一致的染色体数，即可认为是该种质的染色体数目。选取5个染色体形态清楚并且无重叠的细胞，参照李懋学[22]等、陈瑞阳[23～24]的标准进行核型分析。依据Stebbins[25～26]的分类标准进行核型分类，采用Arano[27]的方法计算核不对称系数，参照Guo[28]的方法计算染色体相对长度。

表1 芍药属5个伊藤杂种的基本信息

2 结果和分析

2.1 倍性鉴定

根据镜检结果，5份伊藤杂种的染色体基数均为x=5，倍性一致，均为三倍体(2n=3x=15)，共15条染色体(图1)。

2.2 核型分析

5份伊藤杂种的体细胞中期染色体组各组染色体的核型参数结果见表2，主要核型参数见表3，染色体核型图见图2，染色体核型模式图见图3。

2.2.1 ‘Border Charm’

体细胞染色体数2n=3x=15，核型公式2n=3x=15=9m+3sm+3st，染色体相对长度15.79%～24.28%，相对长度组成2n=3x=9M2+6M1。臂比值变化范围1.08～3.18，最长染色体与最短染色体长度比1.54，核不对称系数61.02%，着丝粒指数23.94%～47.96%，其核型属于2A型。

表2 芍药属5个伊藤杂种的核型参数

图1 芍药属5个伊藤杂种的染色体中期核形态图 图中编号对应表1中的编号，下同。Fig.1 The metaphase chromosomes of five Itoh hybrid peonies The numbers of the figure correspond to the numbers in Table 1,the same as below.

材料编号Code品种Cultivars倍性Ploidy相对长度Relativelength(%)平均臂比值Meanarmratio最长/最短Lt/St核不对称系数Asymmetryindex(%)相对长度指数CRL核型分类Karyotype平均着丝粒指数Averagecentromericindex(%)1‘BorderCharm’2n=3x=1515．79～24．281．831．5461．029M2+6M12A37．762‘GoingBananas’2n=3x=1515．19～24．711．861．6361．939M2+6M12A36．863‘LemonDream’2n=3x=1514．84～25．192．171．7062．413L+3M2+6M1+3S2A35．894‘OldRoseDandy’2n=3x=1515．75～24．751．711．5761．983L+3M2+9M12A38．995‘PrairieCharm’2n=3x=1516．04～25．111．881．5761．713L+3M2+9M12A37．35

图2 芍药属5个伊藤杂种的核型图Fig.2 Karyotypes of five Itoh hybrid peonies

图3 芍药属5个伊藤杂种的染色体模式图Fig.3 Ideograms of five Itoh hybrid peonies

2.2.2 ‘Going Bananas’

体细胞染色体数2n=3x=15，核型公式2n=3x=15=9m+3sm+3st，染色体相对长度15.19%～24.71%，相对长度组成2n=3x=9M2+6M1。臂比值变化范围1.26～3.04，最长染色体与最短染色体长度比1.63，核不对称系数61.93%，着丝粒指数24.76%～44.15%，其核型属于2A型。

2.2.3 ‘Lemon Dream’

体细胞染色体数2n=3x=15，核型公式2n=3x=15=9m+3sm+3st，染色体相对长度14.84%～25.19%，相对长度组成2n=3x=3L+3M2+6M1+3S。臂比值变化范围1.19～4.79，最长染色体与最短染色体长度比1.70，核不对称系数62.41%，着丝粒指数17.26%～45.66%，其核型属于2A型。

2.2.4 ‘Old Rose Dandy’

体细胞染色体数2n=3x=15，核型公式为2n=3x=15=9m+3sm+3st，染色体相对长度为15.75%～24.75%，相对长度组成2n=3x=3L+3M2+9M1。臂比值变化范围1.18～3.02，最长染色体与最短染色体长度比1.57，核不对称系数61.98%，着丝粒指数24.85%～45.94%，其核型属于2A型。

2.2.5 ‘Prairie Charm’

体细胞染色体数2n=3x=15，核型公式为2n=3x=15=9m+3sm+3st，染色体相对长度为16.04%～25.11%，相对长度组成2n=3x=3L+3M2+9M1。臂比值变化范围1.18%～3.63%，最长染色体与最短染色体长度比1.57，核不对称系数61.71%，着丝粒指数21.62%～45.80%,其核型属于2A型。

3 讨论

本研究首次对芍药属伊藤杂种的倍性和核型参数进行报道。5个伊藤杂种的染色体基数均为5，与牡丹、芍药的染色体基数一致，均为整倍体。牡丹目前仅有“首案红”被报道为三倍体[12]，而芍药倍性丰富，二倍体、四倍体均存在。因此本文中的伊藤杂种，其形成推断为“四倍体(母本)×二倍体(父本)”。

结果表明，5个伊藤杂种染色体核型比较稳定，但是仍然存在一定的差异性。本研究中的伊藤杂种染色体核型都由3组中部(m)、1组近中部(sm)和1组近端部(st)组成，核型分类其均属于2A型。牡丹组染色体核型主要有三种类型，即2n=2x=10=6m+2sm+2st、2n=2x=10=8m+2st和2n=2x=10=8m+2sm[8～11]，芍药组染色体核型为2n=2x=10=6m+2sm+2st或2n=4x=20=12m+4sm+4st[15]。根据Stebbins[25～26]的观点,核型进化的基本趋势是由对称向不对称发展的，植物核型越对称，该植物越原始，反之植物核型越不对称，该植物越进化。芍药属各野生种或品种的核型公式，具有2n=2x=10=6m+2sm+2st或2n=4x=20=12m+4sm+4st的种类的不对称性最高,具有2n=2x=10=8m+2st的野生种或品种次之,2n=2x=10=8m+2sm的野生种或品种最原始。本研究中的5个伊藤杂种核型公式均为2n=3x=15=9m+3sm+3st，核型不对称系数为61.02%～62.41%，核型公式不对称性最高，不对称系数较大，说明其在芍药属中属于比较进化的核型。

染色体是基因的载体，具有相对稳定性，不容易受环境条件的影响而发生变异。种质资源在细胞学上的遗传多样性，可通过染色体核型上的差异得以表现[29～35]。三倍体植物在减数分裂联会时通常会形成三价体、单价体甚至是多价体等二价体以外的构型，染色体的分离发生紊乱，因此常常是高度不育[36]。但是三倍体不育性并不是绝对的，在杨树[37]、卷丹[38]、百合[39]中，三倍体植株曾多次被作为杂交亲本，获得一定的后代，选育了部分优良品种。本研究中的5种伊藤杂种均为三倍体，在今后的研究中，应积极发挥芍药属伊藤杂种三倍体的育种潜能，通过产生的可育性配子，开展倍性育种和基因渗入育种，培育优良新品种，或者组培等方式扩繁培养优秀品系，或诱导并获得六倍体植株，为今后的芍药品种改良奠定良好的基础[40]。

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This work was financially supported by Graduate Training and Development Program of Beijing Municipal Commission of Education(BLCXY201615)；National Natural Science Foundation of China(31400591)

introduction：YANG Liu-Hui(1992—),female,master,mainly engaged in resources and breeding of herbaceous peony.

date:2017-02-21

PloidyIdentificationandKaryotypeAnalysisofFiveItohHybridPeonies

YANG Liu-Hui1,2,3ZHANG Jian-Jun1,2,3WANG Qi1,2,3ZHU Wei1,2,3ZHANG Teng1,2,3YU Xiao-Nan1,2,3*

(1.College of Landscape Architecture,Beijing Forestry University,Beijing 100083；2.Beijing Key Laboratory for Flower Germplasm Innovation and Molecular Breeding,Beijing 100083；3.National Engineer Research Center for Floriculture,Beijing 100083)

We studied the karyotypes of five Itoh hybrid peonies by using squashing method. Five Itoh hybrid peonies were triploid(2n=3x=15). Asymmetry index ranged in 61.02%-62.41%, and the karyotypes of these cultivars were 2A. The karyotypes of the tested Itoh hybrid peonies were mainly made of median region, submedian region and subterminal region, without satellite. Our result provided cytological information and polyploidy resources for breeding research for the first time.

Itoh hybrid peonies;triploid;karyotype chromosomes

受北京市教育委员会科学研究与研究生培养共建项目资助(BLCXY201615)；国家自然科学基金(31400591)

杨柳慧(1992—)，女，硕士研究生，主要从事芍药资源与育种方面的研究。

* 通信作者：E-mail:yuxiaonan626@126.com

2017-02-21

* Corresponding author：E-mail:yuxiaonan626@126.com

S628.1+2

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.04.0008