84K杨愈伤组织再生体系和直接分化再生体系遗传转化的比较性研究

王丽娜 王玉成 杨传平

(东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040)

84K杨愈伤组织再生体系和直接分化再生体系遗传转化的比较性研究

王丽娜 王玉成 杨传平*

(东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040)

植物转基因必须以建立良好的植物转化受体系统为基础,而良好的受体系统必须以具有高频率的转化率及较强的再生能力为前提。实验以84K杨叶片为材料研究其在不同培养条件、不同种类及浓度的植物激素对其脱分化及再分化的影响，并建立了两种成熟的组织再生系统，得出组织培养体系与遗传转化体系的受体系统在激素配比方面存在一定差距，所以在此基础上进行了PCK1、PCK2两个基因的愈伤途径和不定芽途径途径的遗传转化，并对两种遗传转化体系进行了对比性分析并总结出两种体系的优缺点。

84K杨；愈伤组织；直接分化；遗传转化

自从Parson等人[1]在1986年证实了杨树可以进行遗传转化以来，以杨树为受体的林木基因工程取得了很大的进展，杨树组织培养技术的广泛应用及深入研究，对植物细胞的分化与脱分化，组织、器官的形态发生与建成，各种代谢调节机理及基因表达和调控规律等众多基础理论问题具有重要的意义，并能从多条途径直接服务于生产实际[2]。84K杨叶片良好的植株再生系统的建立以及实验室在此基础上开展的诸多基因转化84K杨(Populusalba×Populusglandulosa)的研究，不仅可为进一步研究发育生理、细胞分化以及形态建成等许多基础理论问题提供新的实验系统，而且为利用现代生物技术改良杨树品种、加速育种进程、促进优良种苗的快速繁殖与利用等奠定了基础[3],本研究采用两种转基因方法结合使用进行遗传转化体系的规律总结，旨在比较直接分化的遗传体系和脱分化、再分化相结合的遗传转化体系的转化规律，建立两种高效表达、高效转化、稳定遗传的适合杨树派系的遗传转化体系。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试材料为东北林业大学林学院林木遗传育种实验基地种植的84K杨(Populusalba×Populusglandulosa)。

1.2 实验方法

1.2.1 外植体脱毒的方法

剪取84K杨枝条进行水培，取萌发的嫩枝作为外植体，置于自来水下冲洗1 h，去除表面污垢，在超净台上将枝条剪成2～4 cm长、至少带一个叶芽的茎段[4]。用酒精浸泡30 s，无菌水漂洗2～3次，用0.2%升汞溶液浸泡5 min[5]，期间不断搅动，之后用无菌水漂洗4～5次，最后用无菌滤纸吸干，将脱毒后的茎段置于MS培养基接种并扩繁。

1.2.2愈伤组织再生体系和农杆菌介导的愈伤组织再生体系的主要方法

愈伤组织再生系统利用培养条件的不同将脱分化与再分化过程分开(光照与黑暗)，愈伤诱导体系也被称为“暗诱导法”和“两步成芽法”，外植体在黑暗条件下1～2个月后先经脱分化诱导形成直径约为1～2 cm的愈伤，将其移至光下继续诱导1～2个月后，最终获得再生植株的方法。这种方法可使用的外植体范围广泛，经试验证明，多数植物组织、器官均能产生愈伤组织，该培养方式普遍适用于通过离体培养途径能再生的植物[6～7]。农杆菌介导的暗诱导法是外植体经农杆菌侵染后，经过共培养阶段后，继续黑暗1～2个月诱导出愈伤后，再移至光下诱芽的培养方法，主要分为五个阶段，分别为：共培养阶段、黑暗下诱导愈伤阶段、光照下愈伤诱导不定芽阶段、不定芽抽茎阶段及生根阶段[9]，愈伤诱导培养基激素使用比例的筛选方式见表1。

表184K杨愈伤组织诱导体系培养基激素的选择

Table1Thehormoneselectionofculturemediafortheinductionof84Kpoplarcallusinductionsystem

编号No．KT浓度TheconcentrationofKT(mg·L-1)2，4⁃D浓度Theconcentrationof2，4⁃D(mg·L-1)6BA浓度Theconcentrationof6BA(mg·L-1)10．020．10．0220．050．20．0530．10．30．140．20．50．250．50．750．561．01．01．072．02．02．0

1.2.3直接分化体系和农杆菌介导的直接分化体系的主要方法

直接分化体系也被称为“光诱导法”和“一步成芽法”，是指外植体(组织或者器官)不经过愈伤阶段直接诱导不定芽，直接分化出的不定芽再形成再生植株的系统[8]。农杆菌介导的光诱导是外植体被农杆菌侵染后，经共培养阶段后直接置于光照下诱导分化不定芽的一种转化方法，其遗传转化主要分为4个阶段，分别为：共培养阶段、不定芽诱导阶段、不定芽抽茎阶段及生根阶段，不定芽诱导培养基及其使用激素比例的筛选方式见表2。

表284K杨直接分化不定芽培养基激素的选择

Table2Thehormoneselectionofculturemediafortheinductionof84Kpoplardirectdifferentiationofadventitiousbuds

1.2.4 两种转化方案的流程

按照两种转化方案进行遗传转化时的流程示意图见图1，两种转化方案在共培养之前所有的操作是相同的，黑暗下共培养2天后，暗诱导的遗传转化是继续黑暗培养，但需要更换选择培养基，每10天左右更换一次，进行选择培养，等愈伤全部长出后，再移至光下，更换诱芽培养基进行不定芽诱导。暗培养的五个阶段分别为：共培养阶段、黑暗下诱导愈伤阶段、光照下愈伤诱导不定芽阶段、不定芽抽茎阶段及生根阶段。光诱导法是共培养两天后，移至光下诱导，更换各种不同类型的选择培养基，共4个培养阶段分别为：共培养阶段、光下不定芽诱导阶段、不定芽抽茎阶段及生根阶段。

2 结果与分析

2.1普通植株的愈伤诱导体系及其遗传转化时的愈伤诱导体系

利用培养条件将脱分化与再分化过程分开，外植体的细胞在经历了完整的脱分化后回到分生细胞水平，易于接受外源基因，转化效率更高，可获得较多的转化子，但此方法获得的愈伤组织和在此基础上分化的不定芽的嵌合体比例较高[10]。农杆菌介导的愈伤诱导途径时，5号培养基及其激素比例在遗传转化时诱导愈伤组织时间最短。黑暗培养15～20天时，叶片伤口边缘逐渐出现褶皱，叶柄处开始膨大、变红。25天左右出现愈伤组织，并继续膨大，叶柄、叶尖切口处以及叶背贴近培养基的部位长出米粒大小黄色愈伤组织，结构较为硬实，多数愈伤颜色初期为黄色，有的愈伤为松软的白色(图2)，慢慢变绿，再继续培养，更换诱导不定芽培养基，愈伤组织开始诱导不定芽。

图1 遗传转化时愈伤组织再生体系(暗诱导)和直接分化体系(光诱导)流程图Fig.1 Schematic of callus regeneration in genetic transformation(dark-induced) and direct differentiation of tissue regeneration(light-induced)

Table3Thecompositionofculturemediumandtheconcentrationofhormoneinordinarycallusregenarationsystemof84kPoplar

普通愈伤组织再生体系的不同阶段Thedifferentstagesofordinarycallusregenatationsystem培养基组成Compositionofculturemedium诱导愈伤阶段CallusinductionperiodMS+0．2mg·L-1KT+0．5mg·L-12，4⁃D+0．2mg·L-16BA愈伤分化不定芽阶段TheperiodofcallusinducedadventitiousbudMS+0．02mg·L-1TDZ不定芽抽茎阶段ElongationstageofadventitiousbudsMS+0．3mg·L-16BA+0．05mg·L-1NAA生根阶段Thematurestageofadventitiousbudrooted1/2MS

表4 遗传转化时愈伤组织再生体系的培养基及激素配比

图2 遗传转化时愈伤组织再生体系诱导流程 A,B.愈伤前期和后期；C.愈伤诱导不定芽；D.愈伤大量诱导不定芽出现；E.不定芽伸长阶段；F.不定芽生根成熟阶段Fig.2 The induced process of callus regenaration system in transgenic transformation A,B.Earlier period and the later period of callus; C.Callus induced adventitious bud; D.A large number of callus induced adventitious bud; E.Elongation stage of adventitious buds; F.The mature stage of adventitious bud rooted

图3 遗传转化时直接分化体系的诱导流程 A.侵染后的84K叶片；B.光下直接诱导不定芽；C.不定芽抽茎；D.移栽苗Fig.3 Direct differentiation of regeneration system A.After the infection of 84K leaves; B.Light directly induce adventitious bud; C.The mature stage of adventitious bud rooted; D.Plant domestication

2.2直接分化体系及其用于遗传转化时的直接分化体系

直接分化体系是指外植体不经过愈伤阶段直接诱导不定芽的过程，直接分化出的不定芽再形成完整再生植株的体系。该方法因为省去了诱导愈伤组织的过程，因此实验周期短、操作简单，由于未经过脱分化的植株直接分化出芽，该体系的体细胞无性系变异小，在保持受体植物的遗传稳定性的同时能较好的保持转化外源基因的遗传稳定性[11]，但是由于外植体细胞直接分化出组织或者器官较困难，因此转化效率低是此种方法的弊端[12]，但直接分化途径的遗传转化培养比较稳定并且变异率很低，因为这个原因，器官直接培养成为杨树组织培养中较为常用的方法(图3)[13]。

表5普通植株直接分化再生体系的培养基及激素配比

Table5Thecompositionofculturemediumandtheconcentrationofhormoneinordinarydirectdifferentiationofregenerationsystem

直接分化体系的不同阶段Thedifferentstagesofordinarydirectdifferentiationofregenerationsystem培养基组成Compositionofculturemedium不定芽诱导阶段TheinductionofadventitiousbudMS+0．2mg·L-1NAA+0．1mg·L-1KT+0．1mg·L-16BA+0．002mg·L-1TDZ抽茎阶段TheperiodofcallusinducedadventitiousbudMS+0．3mg·L-16BA+0．05mg·L-1NAA生根阶段Thematurestageofadventitiousbudrooted1/2MS

表6遗传转化时直接分化体系的培养基及激素配比

Table6Thecompositionofculturemediumandtheconcentrationofhormoneingenetictransformationofdirectdifferentiationofregenerationsystem

直接分化体系的不同阶段Thedifferentstagesdirectdifferentiationofregenerationsystem培养基组成Compositionofculturemedium不定芽诱导阶段TheinductionofadventitiousbudMS+0．5mg·L-1NAA+0．2mg·L-1KT+0．2mg·L-16BA+0．005mg·L-1TDZ+50mg·L-1kanamycin+300mg·L-1cefotaxime抽茎阶段TheperiodofcallusinducedadventitiousbudMS+0．5mg·L-16BA+0．1mg·L-1NAA+50mg·L-1kanamycin+300mg·L-1cefotaxime生根阶段Thematurestageofadventitiousbudrooted1/2MS+50mg·L-1kanamycin+300mg·L-1cefotaxime

表7 采用明转法和暗转法的84K杨转化效率对比性分析

2.3农杆菌介导的84K杨遗传转化时愈伤组织途径和直接分化途径的转化效率的对比性分析

表7为PCK1、PCK2两个基因采用明转法和暗转法的转化效率比较结果分析，所有的转化子均在卡纳霉素浓度为50 mg·L-1和头孢浓度为300 mg·L-1的基础上获得的数据。PCK1、PCK2两个基因采用暗转法时，从数据中可以看出，转化效率较高，分别为：94.5%和89%。而两个基因在采用明转法时转化效率只有：8.5%和7%。

3 讨论

一个高效、完整的植物再生系统是建立遗传转化系统的基础，更是其先决条件，从实验数据显示，组织培养体系与遗传转化体系在激素浓度的使用上是有差别的。本实验选用的84K杨树具备高效、稳定的再生能力，能接受外源DNA的整合并稳定遗传等优点。本研究建立了两种组织培养再生系统，对PCK1、PCK2两个基因进行了遗传转化，研究其在不同培养条件下、不同种类及浓度的植物激素对其脱分化及再分化的影响，同时使用不同激素配比进而对比不同效果，寻找最佳配方。84K杨正常愈伤组织诱导体系的高效培养基为：MS+0.2 mg·L-1KT+0.5 mg·L-12,4-D+0.2 mg·L-16BA。84K杨遗传转化时愈伤组织诱导体系的最佳培养基为：MS+0.5 mg·L-1KT+0.75 mg·L-12,4-D+0.5 mg·L-16BA+50 mg·L-1kanamycin+300 mg·L-1cefotaxime。84K杨正常愈伤组织诱导不定芽体系的高效培养基为：MS+0.02 mg·L-1TDZ。84K杨遗传转化时愈伤组织诱导不定芽再生体系的高效培养基为：MS+0.05 mg·L-1TDZ+50 mg·L-1kanamycin+300 mg·L-1cefotaxime。84K杨普通植株直接分化体系的最佳培养基为：MS+0.2 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-1KT+0.1 mg·L-16BA+0.002 mg·L-1TDZ。84K杨遗传转化时直接分化体系的最佳培养基为：MS+0.5 mg·L-1NAA+0.2 mg·L-1KT+0.2 mg·L-16BA+0.005 mg·L-1TDZ+50 mg·L-1kanamycin+300 mg·L-1cefotaxime。84K杨普通植株直接分化再生体系的抽茎阶段最佳培养基为：MS+0.3 mg·L-16BA+0.05 mg·L-1NAA。84K杨遗传转化时直接分化体系的抽茎阶段最佳培养基为：MS+0.5 mg·L-16BA+0.1 mg·L-1NAA+50 mg·L-1kanamycin+300 mg·L-1cefotaxime。

在培养基中添加不同浓度的激素对愈伤组织的诱导分化有很大的影响，如本实验在诱导愈伤时添加不同浓度的激素和不同配比的激素，主要添加的是细胞生长素和细胞分裂素，愈伤组织特征不具有一致性，激素浓度不同，愈伤的形态也不尽相同，用所谓的“激素杠杆”来调节植株生长，使其达到最佳状态。如图4A激素浓度偏低，愈伤乳白色，表面呈透明状水状，结构松散，块状、分化不定芽的时间长、分化效率低，生长缓慢；图4B激素浓度过高，愈伤变红，分化时间短，但高到一定程度(图4C)植物停止分化，总结这些规律对今后用不同浓度激素配比调控愈伤生长起到理论层面的指导。

图4 愈伤组织再生体系中不同浓度激素配比对愈伤形成的影响Fig.4 The influence of different concentration hormone to callus formation in the callus regeneration system

杨树转基因体系虽转化较成熟，尤其是白杨派转基因体系，但农杆菌介导法转化杨树的遗传转化体系目前仍存在很多缺点[14]，稳定性和转化效率低等问题仍是转基因体系的构建中面临的主要问题[15]，尤其是存在着同一转化流程在不同实验室间的重复性不佳、不同操作人员间的转化效率差别较大、同一实验室的转化效率稳定性较差等问题，在很大程度上限制了杨树规模化转基因技术体系的进一步深化。尽管科研工作者已针对这些问题开展了大量的研究，也取得了一些技术上的突破，但这些转化流程的实验室间的重演性和稳定性依然不高[16]。多年的实验经验表明，基因转化是一种随机小概率事件[17]，又是需要从量变到质变的积累过程。既然属于小概率事件，那么转化事件的发生必须起始于量的积累，只有量积累到一定阶段，才会产生质变。也就是说，两种转化方法的同时使用，愈伤组织转化体系和直接分化组织转化体系相互结合，在保证转化条件的同时，必须经过大量的转化与筛选，只有这些条件都具备才算做是一个成功的转化实验。

1.Parsons T J,Sinkar V P,Stettler R F,et al.Transformation of Poplar byAgrobacteriumtumefaciens[J].Nature Biotechnology,1986,4(6):533-536.

2.赵清爽.84K杨组织培养及基因转化的研究[D].西安:陕西师范大学,2003.

Zhao Q S.Studies on the tissue culture and gene transformation of Poplar 84[D].Xi’an:Shanxi teacher’s university,2003.

3.周熙莹.84K杨再生和遗传转化体系的研究[D].哈尔滨:东北林业大学,2013.

Zhou X Y.Research on 84K populus regeneration and genetic transformation system[D].Haerbin:Northeast Forestry University,2013.

4.Liesebach M,Naujoks G.Approaches on vegetative propagation of difficult-to-rootSalixcaprea[J].Plant Cell Tissue and Organ Culture,2004,79:239-247.

5.王蒂.植物组织培养[M].北京:中国农业出版社,2004:12-18.

Wang D.The tissue culture in plant[M].Beijing:China Agriculture Press,2004:12-18.

6.Jin J Z,Liang S,Hui C,et al.An efficientAgrobacterium-mediated transformation method for the edible mushroomHypsizygusmarmoreus[J].Microbiological Research,2014,169(9-10):741-748.

7.Kayani W K,Fattahi M,Palazòn J,et al.Comprehensive screening of influential factors in theAgrobacteriumtumefaciens-mediated transformation of the Himalayan elixir:Ajugabracteosa,Wall.ex.Benth[J].Journal of Applied Research on Medicinal & Aromatic Plants,2016,3(4):151-159.

8.Kalbande B B,Patil A S.Plant tissue culture independentAgrobacteriumtumefaciens,mediated In-planta,transformation strategy for upland cotton(Gossypiumhirsutum)[J].Journal of Genetic Engineering & Biotechnology,2016,14(1):9-18.

9.Rodrigues M B C,Fávaro L C D L,Pallu A P D S,et al.Agrobacterium-mediated transformation ofGuignardiacitricarpa:An efficient tool to gene transfer and random mutagenesis[J].Fungal Biology,2013,117(8):556-568.

10.付成华,沈宝仙.I-72杨再生体系的建立[J].华中农业大学学报,2006,25(5):564-566.

Fu C H,Shen B X.Establishment of Plant Regeneration ofPopuluseuramericanaSan Martino[J].Journal of Huazhong Agricultural University,2006,25(5):564-566.

11.Ziemienowicz A.Agrobacterium-mediated plant transformation:Factors,applications and recent advances[J].Biocatalysis & Agricultural Biotechnology,2014,3(4):95-102.

12.Martins P K,Ribeiro A P,Kobayashi A K,et al.A simple and highly efficientAgrobacterium-mediated transformation protocol forSetariaviridis[J].Biotechnology Reports,2015,6:41-44.

13.赵华燕,卢善发.杨树的组织培养及其基因工程研究植物学通[J].植物学通报,2001,18(2):169-176.

Zhao H Y,Lu S F.Studies on Tissue Culture and Gene Engineering of Poplar[J].Chinese Bulletin of Botany,2001,18(2):169-176.

14.Mallesham Bulle.Agrobacteriumtumefaciens-Mediated transformation of Woodfordia fruticosa[J].Journal of Genetic Engineering and Biotechnology,2015,13(2):201-207.

15.张颖,王猛,柴娜.杨树叶片离体再生系统的构建[J].山东农业科学,2010,5(37):8-10.

Zhang Y,Wang M,Chai N.Establishment of invitro Regenaration system of Poplar leaves[J].Shandong Agriculture Sciences.2010,5(37):8-10.

16.于志水.白杨无性系茎尖培养及体细胞胚胎发生技术研究[D].北京:北京林业大学,2005.

Yu Z S.Shoot culure and somatic embryogenesis in Aspen Clones[D].Beijing:Beijing Forestry University,2005.

17.孟庆敏.复叶槭组织培养再生体系的建立[D].哈尔滨:东北林业大学,2006.

Meng Q M.Establishment of Plant Regeneration system cultured in vitro ofAcernegundoL.[D].Haerbin:Northeast Forestry University,2006.

Fundamental Research Funds for the Central Universities(2572016BA02)；Harbin applied technology research and development project(2016RAQXJ065)

introduction：WANG Li-Na(1979—),female,Mainly Engaged in Forest Tree Genomics.

date:2017-02-02

TheComparativestudyofCallusandDirectDifferationRegenarationSystemof84KPoplar

WANG Li-Na WANG Yu-Cheng YANG Chuan-Ping*

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Northeast Forestry University,51 Hexing Road,Harbin 150040)

High-frequent transformation and strong regeneration ability of plants are prerequisites to the establishment of good plant transformation receptor system, which is the foundation for plant genetic transformation. Taking 84K poplar leaves as study material, this experiment studies the influence of different types and concentrations of plant hormones to its dedifferentiation and re-differentiation under different cultivation conditions, and sets two mature plant tissue cultivation regeneration system. Based on above,here establishes genetic transformation system of adventitious buds and callus pathway, respectively as callus regeneration system and regeneration system of direct differentiation. Then through conducting comparative analysis of two tissue culture system usingPCK1 andPCK2, here summarizes the advantages and disadvantages of two methods.

Poplar84K；callus；direct differation；genetic transformation

中央高校基本科研业务费专项资金项目(2572016BA02)；哈尔滨市应用技术研究与开发项目(青年后备人才A类)(2016RAQXJ065)资助

王丽娜(1979—),女,讲师,主要从事林木基因组研究。

* 通信作者：E-mail:yangcp@nefu.edu.cn

2017-02-02

* Corresponding author：E-mail:yangcp@nefu.edu.cn

Q75

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.04.009