梁山慈竹体细胞突变体No.30的SLAF-seq特异分子标记分析

王懋林 胡尚连* 曹 颍 卢学琴 徐 刚 黄 艳 龙志坚

(1.西南科技大学植物细胞工程实验室，绵阳 621010； 2.四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心，绵阳 621010)

梁山慈竹体细胞突变体No.30的SLAF-seq特异分子标记分析

王懋林1,2胡尚连1,2*曹 颍1,2卢学琴1,2徐 刚1,2黄 艳1,2龙志坚1,2

(1.西南科技大学植物细胞工程实验室，绵阳 621010；2.四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心，绵阳 621010)

梁山慈竹体细胞突变体No.30具有纤维素含量高、木质素含量高、纤维细胞长度长、纤维细胞长宽比大等特点，但由于梁山慈竹主要进行无性繁殖，不易获得纯合植株，突变体No.30的分子水平鉴定一直无法进行，严重阻碍了该突变体的推广利用。对梁山慈竹体细胞突变体No.30进行特异分子标记分析，并初步确定其性状变异来源。本研究利用SLAF-seq技术分别对突变体No.30以及同地区野生型梁山慈竹群体(CK)的基因组进行了简化基因组测序。经过了测序、建库、多态位点开发、特异多态性位点筛选等过程，最后对特异多态性位点筛选结果进行注释分析。结果发现突变体No.30的GC含量、纯合InDel数低于野生型梁山慈竹，而检测到的InDel总数以及杂合InDel数却高于野生群体。对SLAF-seq得到的InDel、SNP位点进行特异性筛选，获得了突变体No.30中稳定存在的特异InDel/SNP标签，包括特异C-T转换9381个、特异A-G转换9472个、特异InDel 329个。通过对这些特异SLAF标签进行注释，发现有6个特异SNP标签和1个特异InDel与纤维素合成相关，3个特异SNP标签与木质素合成相关，以及4个特异SNP标签和1个特异InDel与纤维细胞形态建成有关。这些结果表明突变体No.30在体细胞培养的过程中在基因组水平上发生了突变，并初步确定了其性状变异来源。但这些特异SLAF标签与突变体No.30在纤维素含量和木质素含量，以及纤维细胞发育等性状方面的相关性仍需进一步验证。

克隆植物；突变体鉴定；梁山慈竹；体细胞无性系；SLAF-seq

自然条件下产生基因型一致，并具有潜在独立于母体生存能力的分株的过程称为克隆生长(Clonal growth)，具有克隆生长习性的植物称为克隆植物(Clonal plants)[1]。竹子作为克隆植物的一种，是重要的生态、生产和文化资源。发掘出竹子具有优良性状的突变体将会产生很大的经济文化价值，而过程中最关键的一步便是对突变体进行鉴定。植物突变体的鉴定，是开发各种水平的遗传标记，并对这些遗传标记进行遗传分析的过程。然而对于竹子这种开花困难、很难获得纯合植株的克隆植物，对其进行遗传分析是非常困难的。

以往对开花困难的克隆植物的突变体研究大多集中在生理生化及性状描述，极少涉及鉴定过程，有研究[2]利用cDNA-SRAP分子标记对金荞麦(Fagopyrumdibotrys)的辐射诱变突变体进行了研究，初步筛选出了绿茎、红茎、红叶植株之间的差异表达基因，但由于差异表达基因数量不足，未能进行深入研究。其原因可能是cDNA-SRAP技术本身分辨率不足，遗漏了大量信息。

近年来，简化基因组测序技术的高速发展，给开花困难的克隆植物的突变体鉴定带来了曙光。克隆植物主要进行克隆生长，新分株与母株之间基因型一致。通过将突变体与对照的测序结果相比较，发掘出遗传背景一致的野生型、或者同地区的野生型植株群体中不存在的基因型，即可认为突变体在这些位点发生了突变。这些突变位点又因为植物的克隆生长而在新分株中稳定存在。因此，过程中并不涉及遗传分析的过程，克服了开花困难给鉴定带来的阻碍。

SLAF-seq(Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing)是孙效文等人开发的一套简化基因组测序技术，首先用特定的限制酶对基因组进行酶切，再对特定长度的酶切片段开展双端测序，在短时间内获得遍布整个基因组的海量信息，具有通量高、准确度高、可重复性好、成本低等特点[3]。在全基因组关联分析(GWAS)、遗传图谱构建和QTL定位、遗传进化分析、功能基因定位等方面有广泛应用[4～8]。

梁山慈竹(Dendrocalamusfarinosus)是西南地区一个重要的丛生经济竹种，具有抗寒、耐瘠薄、纤维素含量高、材性好等特点，是制浆造纸的优良原料[9]。我们研究室于2009年成功培养再生了一批梁山慈竹的体细胞无性系突变体[10]。其中突变体No.30具有纤维素含量高、木质素含量高、纤维细胞长度长、纤维细胞长宽比大等特点[11]。但是由于梁山慈竹主要进行克隆生长，基于经典遗传学的突变体鉴定方案难以实行，其突变体在分子水平上的变异，尤其是特异的纤维素、木质素以及纤维细胞发育等方面性状的变异来源并不清楚，这极大的限制了竹突变体的研究利用。

本研究利用SLAF-seq技术分别对突变体No.30以及同地区的野生型梁山慈竹群体进行简化基因组测序。经过建库、多态位点开发、特异标签筛选等过程，分析了其突变体在分子水平上的变异。同时，对获得的多态位点所在的SLAF标签序列和毛竹基因组比对并进行注释，初步确定了突变体No.30在纤维素、木质素以及纤维细胞发育等方面的性状变异来源，为竹突变体的研究利用奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

本研究以四川泸州叙永县野生型梁山慈竹及体细胞突变体No.30为研究对象，提取基因组DNA，进行SLAF-seq分析。梁山慈竹体细胞突变体No.30来源于成熟胚离体诱导愈伤组织再生获得的体细胞无性系[11]，于2009年8月获得。通过分兜繁殖，获得遗传背景一致的克隆群体。在2015年取当年生叶片作为基因组提取材料，每个样本3个生物重复，体细胞突变体No.30样本分别编号为30-1、30-2、30-3，野生型梁山慈竹样本分别编号为CK-1、CK-2、CK-3。

1.2 基因组提取

基因组提取采用改良的SDS(Sodium Dodecyl Sulfate)微量提取法，以克服多酚和多糖对基因组提取质量的影响，具体步骤如下：取0.2 g竹叶于液氮中迅速研磨至粉末，迅速转入1.5 ml EP管中，立即加入650 μL 65℃预热的SDS裂解缓冲液和65 μL 5%β-巯基乙醇，65℃水浴30 min；取上清，加入1/3体积的5 mol·L-1KAc(pH=5.2)，冰浴45 min，4℃ 12 000 r·min-1离心10 min；取上清，加入等体积的酚∶氯仿(1∶1)，4℃ 12 000 r·min-1离心10 min；取上清，每管加入3 μL RNaseA(10 mg·mL-1)65℃水浴10 min。加入等体积氯仿抽提(若抽提过程后发现蛋白含量较多，再次进行抽提)；离心并取上清液，加入等体积异丙醇，醇沉1 h；离心弃上清，将沉淀物用1 mL 70%乙醇清洗，自然风干；加入50 μL ddH2O溶解DNA，4℃暂存。取2 μL DNA样品测定DNA的浓度和纯度。取5 μL DNA样品，经含有GREENVIEW的1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。按比例稀释DNA，-20℃保存备用。

1.3 SLAF-seq

基因组样品送至北京百迈客生物科技有限公司进行SLAF-seq。由于梁山慈竹目前尚无基因组序列信息发布，因此，根据梁山慈竹基因组大小及GC含量等信息，选取毛竹基因组作为参考基因组(http://www.bamboogdb.org/page/download.jsp)，进行酶切预测。

根据选定的最适酶切方案，对检测合格的各样品基因组DNA分别进行酶切。对得到的酶切片段进行3′端加A处理、连接Dual-index[12]测序接头、PCR扩增、纯化、混样、切胶选取目的片段，文库质检合格后用Illumina HiSeqTM2500进行测序。为评估酶切实验的准确性，选用日本晴水稻(OryzasativaL. spp.japonica,var.nipponbare，基因组大小374.30M,http://rapdb.dna.affrc.go.jp/)作为对照进行测序。

利用Dual-index对测序得到的原始数据进行识别，得到各个样品的reads。过滤测序reads的接头后，进行测序质量和数据量的评估。通过对照的数据评估切效率，以此判断实验过程的准确性和有效性。根据生物信息学分析，在群体中开发全基因组范围的SNPs和InDels。

测序产生的reads来源于同一限制性内切酶对不同样品作用产生的长度相同的酶切片段，根据序列相似性将各样品的reads进行聚类，聚类到一起的reads来源于一个SLAF片段(SLAF标签)；一个SLAF标签在不同样品间序列有差异(即有多态性)，即定义为多态性SLAF标签。

1.4 突变体No.30的特异标记筛选及注释

由于梁山慈竹是6倍体植物，主要进行克隆生长，母株与新分株之间的基因组比较稳定。根据我们的实验设计方案可知，SLAF开发得到的SNPs和InDels应当包括两部分：(1)梁山慈竹原本具有的群体SNPs及InDels；(2)突变形成的新的SNPs及InDels。因此，需要将群体SNPs及InDels筛除，最终获得同地区的野生型梁山慈竹(CK)中不存在而突变体No.30中稳定存在的SNPs及InDels，具体筛选流程见图1。将这些突变体特有的SNPs、InDels所在的位点被称为特异SNPs、特异InDels位点，特异SNPs/InDels位点所在的多态性SLAF标签称为特异SLAF标签。最后将特异SLAF标签的序列和毛竹基因组进行比对，如果SLAF标签比对到毛竹的基因区，则用对应的毛竹基因组注释结果对特异SLAF标签进行注释。

2 结果与分析

2.1 SLAF-seq建库及测序评估

利用SLAF-predict软件(北京百迈客公司)，根据毛竹基因组进行方案预测，最终选择HaeⅡ+Hpy166Ⅱ进行酶切，SLAF标签长度选择在314～344 bp，预测到242 977个SLAF标签。Control(日本晴水稻)酶切效率为92.42%。通过SOAP[13]软件将Control的测序reads与参考基因组(毛竹)进行比对。结果显示本次实验双端比对效率在为90.52%，SLAF建库正常。

测序质量值(Q)是评估高通量测序单碱基错误率的重要指标，测序质量值越高对应的碱基测序错误率越低，一般将测序质量值(Q)大于等于30作为测序结果较为可靠的标准。经过Illumina HiSeqTM2500测序平台测序，共获得21.23 mol·L-1reads数据，测序平均Q30为89.16%(表1)，测序碱基错误率低。平均GC含量为43%，达到测序要求。用于评估实验建库的准确性的日本晴水稻Control测序获得0.56Mreads的数据量，测序正常。

图1 特异性SNPs/InDels标记筛选流程Fig.1 Specific SNPs/InDels marker screening process

样品编号SampleID总读长数TotalReadsGC含量GC(%)测序质量值Q30Q30(%)CK⁃1322707943．2488．93CK⁃2307595143．3189．92CK⁃3294651243．6289．4930⁃1385999942．4788．9530⁃2411878442．7888．830⁃3400478642．6388．89Rice55722041．2189．15

注：总读长数：各样品的reads总数；测序质量值Q30：测序质量值大于或等于30的碱基所占百分比；GC含量：测序结果中G和C两种碱基所占总碱基的百分比；Rice：用于评估实验建库的日本晴水稻数据

Note:Total Reads：Total reads of each sample； Q30：Percentage of the base thatthe value of the sequencing quality greater than or equal to 30； GC：The percentage of bases G and C in the sequencing results；Rice：Data of Nipponbarewhich was used to evaluate the experimental database

2.2 多态位点开发

测序产生的reads来源于同一限制性内切酶对不同样品作用产生的长度相同的酶切片段，根据序列相似性将各样品的reads进行聚类，聚类到一起的reads来源于一个SLAF片段(SLAF标签)；一个SLAF标签在不同样品间序列有差异(即有多态性)，即定义为多态性SLAF标签。研究共开发了317 621个SLAF标签，所有样品的平均测序深度为10.99x(表2)。SNP标记的开发是以每个SLAF标签中深度最高的序列类型作为参考序列，利用bwa[14]将测序reads比对到参考序列上，并使用GATK[15]和samtools[16]两种方法开发SNP，以两种方法得到的SNP标记交集作为最终可靠的SNP标记数据集，共得到93 886个群体SNP(表2)。InDel标记的开发是以每个SLAF标签中深度最高的序列类型作为参考序列，利用bwa将测序reads比对到参考序列上，共得到4142个InDels(表2)。

表2 多态位点开发结果统计

注:SLAF number：对应样品所含有的SLAF标签数；Average depth：平均每个SLAF上对应样品的测序reads数；Total SNP：检测到的SNP总数；SNP num：对应样品中检测到的SNP个数；Het：对应样品中检测到的杂合InDel个数；Homo：对应样品中检测到的纯合InDel个数；Total InDel：检测到的InDel总数；InDel num：对应样品中检测到的InDel个数

Note:SLAF number：The number of SLAF tags contained in the corresponding samples; Average depth：the average number ofsequencing reads corresponding to each samples; Total SNP：The total number of detected SNP; SNP num：The number of SNP detected in the corresponding samples; Het：The heterozygous InDel number detected in corresponding samples; Homo：The homozygous InDel number detected in corresponding samples; Total InDel：The total number of detected InDel; InDel num：The number of InDel detected in the corresponding samples

表3 特异多态位点注释分析结果

2.3 突变体No.30特异标记筛选及注释

对得到的SNPs和InDels进行筛选，最终获得特异C-T转换9381个、特异A-G转换9472个；特异InDels 329个。将存在上述多态位点所在的SLAF标签序列和毛竹基因组比对，如果SLAF标签比对到毛竹的基因区，则用对应的毛竹基因注释结果对SLAF标签进行注释。共有1 895个存在特异C-T或A-G转换的SLAF标签成功注释，总共注释到1 699个基因上；共有62个存在特异InDel位点的SLAF标签成功注释，共注释到63个基因上。其中有6个特异SNP标签与纤维素合成相关，分别注释到OsCesA6、OsCesA2、OsCesA3、OsCesA1、OsSUSy4、OsSUT4上，有1个特异InDel标签与纤维素合成相关，注释到OsCesA3上。有3个特异SNP标签与木质素合成相关，分别注释到AtCCR1、AtCCOMET、AtMYB86[17]上。有4个特异SNP标签与纤维细胞形态建成有关，分别注释到OsEXP3[18]、AtRIC6[19]、AtRIC11[19]上，有1个特异InDel标签与纤维细胞形态建成有关，注释到AtRIC11[19]上(表3)。

3 讨论

3.1 突变体No.30在基因组水平上发生了突变

SLAF-seq结果显示突变体No.30各样品的GC含量均低于野生型梁山慈竹(表1，P=0.007)。竹作为高等植物，其基因组存在广泛的DNA甲基化，并在竹基因表达、细胞分化以及系统发育中起着重要的调节作用[20]。CpG作为主要的DNA甲基化位点，基因组中60%～90%的CpG都被甲基化，而甲基化通常发生在胞嘧啶C的5号碳原子上[21]，这种被甲基化的胞嘧啶在某些条件下会脱氨基形成胸腺嘧啶T，发生C-T转换[22]。因为竹DNA甲基化在基因组范围内广泛存在，所以上述过程可能是突变体No.30 GC含量降低的主要原因，并进一步暗示了其DNA甲基化水平的变异，以及其它表观遗传学变异。

另外，突变体No.30各样品杂合InDels数均高于野生型梁山慈竹(表2，P<0.001)、纯合InDels数均低于野生型梁山慈竹(表2，P<0.001)、检测到的InDels总数均高于野生型梁山慈竹(表2，P=0.005)。暗示突变体No.30在体细胞无性繁殖过程中，在原有种群基InDels础上产生了新的InDels。

3.2 突变体No.30的性状变异来源

突变体No.30较野生型梁山慈竹有纤维素、木质素含量高，纤维细胞长，长宽比大等特点[11]。我们在多个与这些性状相关的蛋白上发现了特异InDels/SNP标签(表3)。大部分特异标签位于内含子区域，虽然看上去似乎不影响氨基酸序列，但可能在转录翻译过程中影响内含子正常剪切，从而改变蛋白3D结构，甚至完全失活蛋白[23～25]。另外我们发现突变体No.30的CesA3，CCR1两个蛋白可能存在氨基酸变异，CeaA3还同时存在内含子变异。CesA3及CCR1都在相应的生化途径中担任了至关重要的角色，突变体No.30的性状改变可能与其DNA序列的突变密切相关。当然，前文已经论述了突变体No.30表观遗传学变异的可能性，GC含量的降低暗示着基因组甲基化程度的降低、基因组范围内的转录增强[26]，也许能更好地解释突变体No.30为何同时拥有高纤维素含量、高木质素含量两大特点。我们将在接下来的研究中确定突变体No.30的基因组甲基化情况，测定突变体No.30特殊性状相关基因的表达状况，并挑选筛选得到的特异标签进行转化验证。进一步确定突变体No.30的性状变异来源，为进一步的分子育种做好准备。

3.3 开花困难的克隆植物突变体鉴定

竹开花困难，基于经典遗传学的突变体鉴定方案对竹并不适用。SLAF-seq技术作为高度自动化的高通量测序技术，对基因组的特定酶切片段进行双端测序，准确度高，可重复性好。由于竹子主要繁殖方式为克隆生长，母株与新分株之间的基因组相对稳定。只需要将遗传背景相同野生型植株与目标株系的测序结果相比较，便可达到鉴定目的；或者将野生型植株的自然群体混样与目标株系的基因组测序结果相比较，只要在待鉴定株系中发现了稳定遗传且同地区野生型中不存在的“基因型”即可认为其在基因组水平上发生了突变，鉴定过程实际上就是寻找“新出现的基因型”的过程，并且可以根据测序结果，通过与参考基因组的注释，初步确定突变株形状变异的来源，为进一步研究指明方向。

但值得注意的是，基于SLAF-seq的鉴定方案，由于SLAF-seq技术本身的原因，不能识别染色体结构变异。因此，对突变株进行核型分析是十分必要的。

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National Natural Science Foundation of China(31400257,31400333);Breeding Program Fund Project by the 13th Five-Year Plan of Sichuan Province(16ZS212301);Fund of Engineering Research Center for Biomass Resource Utilizaiton and Modification of Sichuan Province(12zxsk07,13zxsk01,14tdgc05)

introduction：WANG Mao-Lin(1989—),male,master,research mainly focuses on plant genetics and variety improvement.

date:2016-11-25

SpecificMolecularMarkerAnalysisoftheSomaclonalMutantNo.30ofDendrocalamusfarinosusthroughSLAF-seq

WANG Mao-Lin1,2HU Shang-Lian1,2*CAO Ying1,2LU Xue-Qin1,2XU Gang1,2HUANG Yan1,2LONG Zhi-Jian1,2

(1.Lab of Plant Cell Engineering Southwest University of Science and Technology,Mianyang 621010；2.Engineering Research Center for Biomass Resource Utilization and Modification of Sichuan Province,Mianyang 621010)

Somaclonal mutant No.30 ofDendrocalamusfarinosushas the specific characteristic of high cellulose and lignin contents, long fiber cells and high length-to-width ratio of fiber cells. Because vegetative propagation is the main way forD.farinosusmultiplies, resulting in the failure of homozygous plants, molecular identification of the mutant has not been performed so far, which severely hinders the popularization and application of mutants. Specific molecular marker analysis of the somaclonal mutant No.30 ofD.farinosusand identify the sources of character variations. A reduced-representation genome sequencing was performed on wild-typeD.farinosusand the mutant No.30 using SLAF-seq technology. After sequencing, library construction, polymorphic sites development, specific screening of polymorphic sites, annotation analysis was carried out on the results of specific screening of polymorphic sites. GC content and homozygous InDel in the mutant No.30 were less than that in the wild type, while total InDel and heterozygous InDel in the mutant No.30 were more than that in the wild type. After specific screening of InDel and SNP sites obtained from SLAF-seq, specific stable InDel/SNP markers including 9381 C-T transition, 9472 A-G transition and 329 InDel were found in the mutant No.30. According to the annotation of these specific SLAF markers, there were 6 SNP markers and 1 InDel related to cellulose synthesis, 3 SNP markers related to lignin synthesis, as well as 4 SNP markers and 1 InDel related to fiber cell morphogenesis. The results revealed genome-level mutations in the mutant No.30 during somatic cell culture, and the sources of character variations were initially identified. However, the correlation between these specific SLAF markers and the characters of the mutant No.30, including cellulose and lignin contents, and fiber cell development, still requires further validation.

clonal plants；mutants identification；Dendrocalamusfarinosus；somaclone；SLAF-seq

国家自然科学基金(31400257，31400333)；四川省“十三五”重点公关资助项目(2016NYZ0038)；四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心基金资助(12zxsk07，13zxsk01，14tdgc05)

王懋林(1989—)，男，硕士研究生，主要从事植物遗传与品种改良研究。

* 通信作者：E-mail:hushanglian@126.com

2016-11-25

* Corresponding author：E-mail:hushanglian@126.com

S795.5

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.04.016