秦巴山区漆树nrDNAITS和cpDNA序列分子进化特点的分析

柏国清 李为民 陈 昊 黎 斌 李思锋

(陕西省植物研究所陕西省植物资源保护与利用工程技术研究中心，西安 710061)

秦巴山区漆树nrDNAITS和cpDNA序列分子进化特点的分析

柏国清 李为民 陈 昊 黎 斌 李思锋*

(陕西省植物研究所陕西省植物资源保护与利用工程技术研究中心，西安 710061)

应用PCR产物直接测序法分析漆树种群nrDNA(核糖体DNA)ITS序列和cpDNA序列(matK、rbcL、psbA-trnH)的碱基差异，初步研究两套植物基因组的变异速率。结果表明：nrDNA ITS序列共有518 bp，有变异位点15处，变异位点百分率为2.9%，(G+C)含量为61.8%。cpDNA序列合并后长度1 907 bp，有变异位点20处，变异位点百分率为1.05%，(G+C)含量为36.1%。通过对ITS序列核糖型(Ribotype)和叶绿体序列单倍型(Haploype)进行分析发现，秦巴山区漆树区域性分布明显，不同区域拥有自己独特的单倍型，漆树居群历史近期没有扩张。nrDNA ITS序列较叶绿体序列进化较快，变异速率较快。nrDNA ITS序列及叶绿体matK、psbA-trnH适合漆树的亲缘地理学研究。

漆树；ITS序列；叶绿体DNA序列

漆树(Toxicodendronvernicifluum(stokes)F.A.Barkley)隶属于漆树科(Anacardiaceae)漆树属(Toxicodendron)植物，落叶乔木。主要分布在我国陕西、重庆、甘肃、湖北、广西、贵州、四川和云南等地区[1]。属亚热带植物区系，新生代第三纪古老孑遗树种[2]，漆树的经济价值很高，不但能满足人类的物质生活需求，也能满足人们的审美情趣。漆树皮层采割的次生代谢物——生漆，是一种优质的天然涂料；漆树木材材质软硬适中，花纹美观，耐腐，耐湿，是建筑、家具、乐器等优质用材；漆树的叶、花、根、皮、果实、干漆都可以入药[3]。经过长期的自然选择和人工驯化栽培，目前我国漆树已经形成众多的漆树品种和类型，具有丰富的漆树种质资源。但分子水平的遗传多样性等方面的研究却远远不足，相关文献屈指可数。在漆树资源领域，目前研究利用AFLP标记结合形态学、解剖学对漆树品种进行鉴定[4]和评价[5]，张金池等人利用AFLP分子标记技术探索不同区域与海拔漆树种源遗传多样性及相关性[6]。对其nrDNA ITS序列和cpDNA序列的研究尚属首次。

早期分子系统学和亲缘地理学研究多应用RFLP、RAPD、SSR和ISSR等技术手段，随着分子生物学技术的快速发展，现多应用核糖体DNA(nrDNA)的18S基因及ITS等非编码区序列进行分析研究，以及叶绿体DNA的编码基因及非编码基因序列和部分线粒体DNA(mtDNA)的基因片段进行分析研究。目前应用最广泛的核基因组是nrDNAITS序列，它是核糖体DNA中介于18S和5.8S之间(ITS1)以及5.8S和26S之间(ITS2)的非编码转录间隔区，具有较高的重组率，成为植物亲缘地理学(phylogeography)研究和探讨科内属间及种间关系中最有效的手段之一[7～8]。叶绿体DNA(cpDNA)多数具有单亲遗传的特性，在遗传过程中不容易发生重组，并且没有基因的重叠、缺失或假基因的现象，拥有独立的进化路线，不依赖其他数据，可以通过自身数据构建分子系统来推测物种的进化历史[9～10]。本文分析了漆树10个居群，111个个体的nrDNAITS序列和叶绿体序列的分子特点和变异情况，并依据序列初步确定该物种现有分布范围的成因和居群历史。

1 材料与方法

1.1 材料

用于本实验的10个居群为2013～2016年份分别采自秦岭、巴山两大山系，基本覆盖了漆树在秦巴山区的分布区。采样时每个居群选取成年植株6～25株，根据随机取样原则，取样的漆树株距在30 m以上。野外采集新鲜、完整的植物幼嫩叶片，置于盛有硅胶的塑胶袋中干燥保存。每个居群采集1～2份凭证标本，保存于陕西省西安植物园标本室(XBGH)。采样编号、凭证标本号及地点见表1。选取同为无患子目的木本植物七叶树(Aesculuschinensis)作为外类群。

表1 漆树居群采样信息表及单倍型分布

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA的提取与检测

依据改良的2×CTAB法[11]从硅胶干燥的叶片中提取总DNA。通过测定紫外光吸收值来确定DNA浓度和纯度。利用1%琼脂糖凝胶电泳检DNA完整性。

1.2.2 PCR扩增与DNA测序

nrDNAITS序列和cpDNA序列的扩增引物见表2。扩增反应在Eppendorf Mastercycler Gradient PCR仪上进行，总反应体积25 μL，其中PCRmix 10 μL，模板DNA(10 ng·mL-1)2 μL，随机引物(1 μmol·L-1)2 μL(正反向引物各1 μL)。扩增程序如下：94℃预变性4 min；35个循环：94℃变性30 s，合适的退火温度退火20 s，72℃延伸20 s；最后72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶检测之后送至上西安擎科泽西生物科技有限公司进行纯化并测序。

表2引物序列及退火温度

Table2Theprimersequencesandannealingtemperaturesusedinthisstudy

引物名称Primername序列Sequences(5′—3′)退火温度Annealingtemperature(℃)参考文献ReferenceITSITS5：GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC54．3[12]matK3F＿KIMf：CGTACAGTACTTTTGTGTTTACGAG1R＿KIMr：ACCCAGTCCATCTGGAAATCTTGGTTC56．1[13]rbcL1F：ATGTCACCACAAACAGAAAC724R：TCGCATGTACCTGCAGTAGC57．9[14]trnH⁃psbAtrnH2：CGCGCATGGTGGATTCACAATCCpsbAF：GTTATGCATGAACGTAATGCTC56．1[15][16]

1.3 数据处理

测序所得序列用MEGA v5.0[17]进行比对校正，用DNASP v5.0[18]统计变异位点，单倍型(Haplotype)类型和变异位点百分率，以及核苷酸多样性，并将nrDNAITS和叶绿体序列进行比较。Tajima’s D和Fu’s Fs两种无限突变位点模型的中性检验方法及矢配(Mismatch distribution)分析也在DNASPv5.0程序中完成，来检验漆树居群间是否经历了近期居群范围扩张。居群总的遗传多样性(HT)和居群内平均遗传多样性(HS)，居群间遗传分化系数GST以及NST值用软件PERMUT v1.2[19]进行1 000次置换检验计算。应用ARLEQUIN v3.5[20]进行分子变异分析(Analysis of Molecular Variance,AMOVA)，参数通过1 000次重复抽样获得。用MEGA v5.0软件进行核苷酸组成分析，采用Kitmura-2-Parameter distance双参数模型(Kimura,1980) 计算遗传距离，并用邻接(Neighbour-Joining,NJ) 法构建系统树，通过1 000次重复获得的自展检验(bootstrap)数值标记在分支上。

2 结果与分析

2.1 漆树nrDNA ITS序列特征和单倍型的分布

漆树nrDNAITS序列总长度518 bp,(G+C)含量为61.8%，变异位点百分率为2.90%。序列共有17处变异位点，其中2处插入/缺失(位于135、136 bp位点处)，15处碱基置换(表3)。共检测到7种核糖型(表1，图1a)。有7个居群(SN、PLD、PLB、ZP、ZS、LYD、LYH)只具有一种核糖型，居群FP具有两种核糖型，居群NS具有三种核糖型。7种核糖型中PLB、ZS、FP、NS共享Hap3核糖型，NS、LYD、LYH共享核糖型Hap6，其余核糖型均为私有核糖型。核糖型Hap1只存在于陕西商南县(SN)，核糖型Hap2只存在于陕西平利县大贵镇(PLD)，核糖型Hap4只存在于陕西镇坪县(ZP)，核糖型Hap5只存在于陕西佛坪县(FP),核糖型Hap7只存在于陕西宁陕县(NS)(图1a)。

表3 漆树nrDNAITS片段7种单倍型进行序列比对的变异位点

注：*表示碱基与核糖型Hap1相同。

Note:* the same as the ribotype Hap1.

2.2 漆树各居群间叶绿体序列及分析

漆树cpDNA序列(matK、rbcL、psbA-trnH)合并后总长度1 907 bp，(G+C)含量为36.1%，变异位点百分率为1.05%。序列共有106处变异位点，其中86处插入/缺失(位于1 597～1 614、1 760～1 820、1 861～1 867 bp位点处)，20处碱基置换(表4)。共检测到5种单倍型(表1，图1b)。有8个居群(SN、PLD、PLB、ZS、NS、LYD、LYH、CA)只具有一种单倍型，居群ZP、FP具有两种单倍型。5种单倍型中，SN、FP共享Hap1单倍型，PLB、ZP、ZS、NS、LYD、LYH、CA共享单倍型Hap3，其余单倍型均为私有单倍型。Hap2为陕西平利县大贵镇(PLD)私有单倍型，Hap4为陕西镇坪县(ZP)私有单倍型，Hap5为陕西佛坪县(FP)私有单倍型(图1b)。

表4 漆树叶绿体片段5种单倍型进行序列比对的变异位点

注：*表示碱基与单倍型Hap1相同。

Note:* the same as the haploid Hap1.

图1 漆树居群地理分布及相应单倍型Fig.1 Tampled populations and the recovered Haplotypes in T.verniciflqiuum

2.3 遗传分化与系统发育分析

基于ITS序列，漆树种群总的单倍型多样性(Hd)为0.838，核苷酸多样性(π)为0.008。Permut结果显示9个居群中，居群间总的遗传多样性(HT)为0.886，远远高于居群内平均遗传多样性(HS=0.131)。居群间分化系数GST和NST的值分别为0.852和0.637，NST0.1)，支持了矢配分析的结果

基于cpDNA序列，漆树种群总的单倍型多样性(Hd)为0.643，核苷酸多样性(π)为0.003。Permut结果显示10个居群中，居群间总的遗传多样性(HT)为0.585，高于居群内平均遗传多样性(HS=0.102)。居群间分化系数GST和NST的值分别为0.825和0.836，NST>GST(P>0.05)，表明漆树居群不存在显著的谱系地理结构。基于cpDNA单倍型的AMOVA分析显示遗传变异主要发生于居群间(82.30%)，表明漆树的遗传变异主要存在于居群间，居群间就有较高的分化水平。在物种水平上对nrDNA进行了矢配分析，得到曲线为多峰曲线(图2b)，背离了快速扩张模型的假设，同时中性检验Tajima’s D值为1.837(P>0.05)，支持了矢配分析的结果。

图2 漆树所有个体nrDNA ITS序列数据(a)及cpDNA基因型序列数据(b)的矢配分析Fig 2. Mismatch distribution for sequences data of nrDNA ITS(a) and cpDNA(b) from all individuals of T.vernicifluum

图3 基于ITS序列的7种核糖型的NJ树(a)及基于cpDNA序列的5种单倍型的NJ树(b)Fig.3 NJ tree based on sevenHaplotypes of ITS sequence(a) and cpDNA sequence(b)

运用MEGA软件对漆树nrDNAITS序列和cpDNA序列所得的单倍型进行系统发育树重建。由图3a可知，由nrDNAITS序列构建的NJ树分为二支，核糖型Hap1单独为一支，Hap2、Hap3、Hap4、Hap5、Hap6、Hap7聚为一支，Hap8为外类群七叶树核糖型。由图3b可知，由cpDNA序列单倍型构建的NJ树分为三支，Hap1和Hap2各自为单独的一支，Hap3、Hap4和Hap5聚为一支，Hap6为外类群七叶树的单倍型。

3 讨论

一般而言，在大多数被子植物中由于叶绿体DNA是母性遗传、非重组并且进化速度比较慢[21]，因此常被用来研究群体遗传学和系统地理学中的遗传瓶颈和奠基者效应，并用于测量遗传漂变[9]。nrDNA ITS区既有核苷酸序列的高度变异、又有长度上保守性，而且进化比较快，可用于解决由于叶绿体变异的水平太低而不能阐明居群的关系问题[22]。目前对植物亲缘地理学的研究从过去的单一叶绿体基因组阶段过渡到叶绿体和核基因组联合分析阶段。核基因组不仅能提供更强有力的证据，而且根据该基因组单倍型地理分布格局进行推测居群的进化历史年代。nrDNA ITS序列是目前研究最广泛的核基因组，将nrDNA ITS序列同cpDNA序列比较发现：nrDNA ITS序列的变异位点百分率率高于cpDNA序列的变异位点百分率。nrDNA ITS区域也会较cpDNA序列保守且变异速率较慢，例如段义忠等[23]对窄叶鲜卑花(Sibiraeaangustata)nrDNA ITS和cpDNAtrnS-G、rpl20-rps12序列特征比较发现，nrDNA ITS的变异速率较慢。而漆树nrDNA ITS序列较cpDNA序列变异位点更多，变异速率较快。因此nrDNA ITS序列适合漆树以局群内进化历史为主要目的的亲缘地理学研究。cpDNA片段matK、rbcL、psbA-trnH被广泛的应用，作为不同植物的DNA条形码标记，在不同种类的植物中效果各不相同。叶婵娟等[24]在对猕猴桃DNA条形码标记的筛选中发现matK具有较高的核苷酸多样性。王柯等[25]对锦葵科植物DNA条形码通用序列筛选中发现psbA-trnH序列的扩增和测序成功率最高，其鉴定成功率为63.25%。对菊科橐吾属植物的DNA条形码研究结果显示叶绿体基因matK、psbA-trnH、rbcL在种内和种间变异都很小[26]。通过表4我们发现rbcL的变异很少，matK、psbA-trnH相对较多。因此matK、psbA-trnH更适合用于漆树亲缘地理学的研究。

nrDNA ITS序列共发现7个核糖型，其中Hap3是分布最广的核糖型，分布于9个居群中的4个居群，在秦岭和巴山两大山脉均有分布。其次是核糖型Hap6，分布于宁陕和略阳两地三个居群。其他核糖型为每个居群所特有。cpDNA序列共发现5个单倍型，其中Hap3是分布最大的单倍型，分布于9个居群中的7个居群，在秦岭山脉的中部西部及大巴山山脉均有分布，分布特点同nrDNAITS序列核糖型中的Hap3相似。叶绿体单倍型Hap1分布于SN和FP，位于秦岭山脉的东部和中部，这与核基因核糖型Hap6类似，Hap6分布于秦岭山脉的中部和西部。其他叶绿体单倍型均为居群特有单倍型。通过序列单倍型的分布我们可以发现，秦岭山脉同巴山山脉具有共有单倍型；秦岭山脉的东部、西部和中部均有共享单倍型，且秦岭山脉中部居群NS、FP的居群遗传多样性较高。核基因核糖型Hap3及叶绿体单倍型Hap3在系统进化树中均处于树的基部(图3)，且这两个单倍型的分布范围最广，即推断它们为古老单倍型。张金池等人[6]利用AFLP分子技术对不同地理种源的漆树进行了遗传多样性分析，得出漆树与区域联系紧密，不同区域的漆树遗传特征具有明显的差异性，同一区域的在分子水平较相近。这一结论同我们的结果相吻合，依据单倍型分布来看，秦巴山区漆树区域性分布明显，不同区域拥有自己独特的单倍型。

据统计基于叶绿体DNA数据被子植物的居群间的总的遗传多样性HT=0.670[27]，而漆树居群间总的遗传多样性(HT=0.585)基本达到被子植物的平均值。但是居群内的平均遗传多样性则非常低(HS=0.102)，我们认为秦巴山区地形结构复杂，存在大量的山区地形，山区之间的气候及环境异质性为漆树提供了适宜的生境，维持了该物种的遗传多样性。

居群空间上的隔离，突变后环境因子的差异造成的选择差异，遗传漂变以及基因流受限而导致居群遗传结构的空间异质性是造成居群分化的重要原因[28]。Petit等[29]使用叶绿体DNA标记对170个物种的居群间遗传分化的研究结果表明这些物种的平均的GST=0.646，而我们的结果(GST=0.825)比这个平均值要高，可能是由于在第四纪冰期时漆树在不同的避难所中发生遗传漂变所造成的。同时分子变异分析(AMOVA)结果表明，漆树nrDNA ITS序列数据及cpDNA序列数据都显示居群间的遗传变异远大于居群内的遗传变异。

漆树nrDNA ITS和cpDNA序列的矢配分析(mismatch distribution)结果表明，观测值与期望值之间比较，得到一个明显的多峰分布曲线图(图2)，表明漆树种群没有发生近期范围的扩张，这一结果也得到了中性检验的支持，nrDNAITS序列的Tajima’s D值为1.374(P>0.1)，cpDNA序列的Tajima’s D值为1.837(P>0.05)。大多数第三纪孑遗植物的种群都发生了种群扩张，刘杰[30]针对第三纪孑遗珍稀植物喜马拉雅红豆杉的研究表明喜马拉雅红豆杉的两个分组水平上都是单峰曲线，揭示种群可能经历了扩张。张永华[31]的研究指出位于秦岭巴山的香果树为一单独的地理组，在近期发生了种群扩张。位于同一地理范围内的第三纪孑遗植物漆树种群则没有发生扩张。并非所有第三纪孑遗植物种群都发生扩张，基于trnL-trnF序列对青藏高原及其毗邻地区的扁蓿豆进行群体遗传结构分析表明，在采样范围内扁蓿豆没有经历明显的近期种群扩张[32]。针对漆树种群是否会经历扩张，我们今后会加大居群采样，采用多种分子标记进行研究。

4 结论

比较发现，漆树nrDNA ITS序列较叶绿体序列进化较快，变异速率较快。nrDNA ITS序列及叶绿体matK、psbA-trnH更适合用于漆树亲缘地理学的研究。通过对ITS序列核糖型(Ribotype)和叶绿体序列单倍型(Haploype)进行分析发现，两者得出的结论一致，即秦巴山区漆树区域性分布明显，不同区域拥有自己独特的单倍型。漆树居群历史近期没有扩张。

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Project supported by National Science and technology support program of China titled “Research and Application of Germplasm Characteristics of Rhus species”(2013BAD01B06-7)

introduction：BAI Guo-Qing(1983—),male,assistant research fellow,mainly engaged in the research of molecular phylogeography.

date:2017-02-16

CharacteristicsofMolecularEvolutionofToxicodendronvernicifluuminQinbaMountainsbynrDNAITSandcpDNASequence

BAI Guo-Qing LI Wei-Min CHEN Hao LI Bin LI Si-Feng*

(Shaanxi Engineering Research Centre for Conservation and Utilization of Botanical Resources,Institute of botany of Shaanxi Province,Xi’an 710061)

We analyzed the differences between nrDNAITS and cpDNA sequences inToxicodendronvernicifluumby PCR direct sequencing. The length of nrDNA ITS sequence ofT.vernicifluumwas 518 bp, of which 15 were variable sites with a percentage of 2.9%, and the(G+C) percentage content was 61.8%. The length of cpDNA sequence ofT.vernicifluumwas 1 907 bp, of which 20 was variable site with a percentage of 1.05%, and the(G+C) content was 36.1%. By ITS sequence Ribotype and chloroplast sequence Haplotypes, the regional distribution of sumac in Qinba Mountains is obvious and different area has its unique haplotype. There is no expansion in the recent history of sumac populations. The evolution ofT.vernicifluumnrDNA ITS sequence is faster than that of chloroplast sequence, and the mutation rate is faster. The nrDNA ITS sequence and cpDNA sequence(matK and psbA-trnH) are fit to the phylogeographic study for this species.

Toxicodendronvernicifluum;ITS sequence;cpDNA sequence

国家科技支撑计划项目(漆树特色种质挖掘与创新利用[2013BAD01B06-7])

柏国清(1983—)，男，助理研究员，主要从事分子系统地理学研究。

* 通信作者：E-mail：lisf60@sina.com

2017-02-16

* Corresponding author：E-mail：lisf60@sina.com

S794.2

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.04.014