响应面优化塔拉种子多糖的超声波提取及其抗氧化性研究

赵寒梅 袁德成 杨逢建

(东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040)

响应面优化塔拉种子多糖的超声波提取及其抗氧化性研究

赵寒梅 袁德成 杨逢建*

(东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040)

为获得塔拉多糖超声波提取的最佳工艺，利用中心组合实验设计原理，采用四因素三水平的响应面分析法，获得多元二次线性回归方程，以多糖提取率为响应值做响应面。并考察塔拉多糖的体外抗氧化活性。结果表明：塔拉多糖的最佳提取工艺条件为，超声辅助提取超声功率363 W，超声温度56℃，超声时间23 min，料液比1∶17(g·mL-1)，塔拉粗多糖的最大提取率(25.56%)与理论推测值(25.71%)相差较小。经纯化后塔拉多糖提取率为17.82%。以VC为阳性对照，对不同纯度的塔拉多糖进行抗氧化性的研究，发现其纯度越高，对ABTS自由基的清除能力越强。

塔拉多糖；提取；响应面法；抗氧化性

塔拉(Caesalpiniaspinosa)属豆科(Leguminosae)植物。其豆荚富含没食子单宁50%～60%(干基计)，是生产医药、化工产品的重要原料[1]。它的种子即塔拉豆，其重量约占气干果荚的35%，塔拉豆内含一层较厚的内胚乳层，又称塔拉胶，其主要成分为杂多糖，主要作为乳化剂、增稠剂、稳定剂、改性剂及医药佐剂，可广泛用于纺织、医药、石油，尤其是食品工业中。是我国作为单宁植物资源从南美洲引种栽培的经济植物。塔拉干果壳经粉碎制成的塔拉粉是重要的化工原料，可用于生产塔拉单宁酸、没食子酸、焦性没食子酸和抗菌素增效剂等多种化工、医药产品[2]。

目前，在塔拉多糖研究领域，文献报道相对较少，塔拉多糖的分离纯化是研究其理化性质、生物活性和化学结构的基础，多糖的纯化是其精制过程中非常重要的一步。本文采用超声波法辅助提取[3～5]塔拉多糖，相较于热水浸提和冷渍提取，提取率较高，也对其抗氧化性进行了相关实验，希望为塔拉多糖的多领域充分利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料及仪器

材料及试剂：塔拉豆，石油醚沸点(60～90℃)、无水乙醇、葡萄糖标准品、苯酚、浓硫酸、ABTS、过硫化钾、VC等均为分析纯。

仪器：台式数控超声波、电子天平、多功能粉碎机、电热鼓风干燥箱、电子天平、冰箱、电热恒温水浴锅、磁力搅拌器、高速离心机、紫外可见分光光度计。

1.2 塔拉粗多糖的提取

1.2.1 塔拉种子的预处理

塔拉种子经55℃烘箱烘干48 h，粉碎过40目筛，再55℃烘干48 h，以1∶14的比例经石油醚脱脂，连续3次，每次24 h，让脱脂的塔拉粉末自然干燥，然后置于55℃烘箱中备用。

1.2.2 绘制葡萄糖标准曲线

准确称取105℃干燥至质量恒定的葡萄糖10.0 mg，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，分别置于10 mL具塞试管中，加入蒸馏水补至2 mL，然后再加入6%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸5.0 mL。摇匀，沸水浴加热20 min后，在冷水中冷却至室温。在490 nm波长处测吸光度。同时用2.0 mL蒸馏水做空白对照。得标准曲线方程：y=14.986x-0.280 31，R2=0.994。

采用苯酚—硫酸法[6～8]，用紫外可见分光光度计测定吸光度，通过所得葡萄糖标准曲线[9～10]计算出多糖的含量，根据下式计算多糖得率：

多糖得率%=比色皿测定浓度×样品稀释倍数×样品溶液体积/试验样品质量×100

(1)

实验样品质量式中：比色皿测定的多糖质量浓度(mg·mL-1)；样品溶液稀释倍数为125；样品溶液体积为25 mL；实验样品质量为4.0 g。

1.2.3 多糖提取率

以多糖提取率为指标，用葡萄糖作为标准物，采用苯酚—硫酸法，在490 nm处测吸光度，得回归方程y=14.986x-0.280 31，R2=0.994，通过回归方程及测得的吸光度计算多糖得率。

1.2.4 超声辅助提取塔拉粗多糖

准确称取塔拉粉末1.0 g，置于50 mL具盖离心管中，在不同提取功率、提取温度、提取时间、料液比的条件下进行单次提取实验，提取完成后在5 000 r·min-1的高速离心机中离心10 min，取上清，以4倍体积的无水乙醇醇沉24 h，再5 000 r·min-1，离心5 min，取上清，弃沉淀，用苯酚—硫酸法测定粗多糖得率，选择得率较高的3个水平进行优化实验。

1.2.5 响应面优化

为了更进一步研究塔拉粗多糖提取过程中诸多因素之间的关系，根据超声辅助提取的4组单因素实验结果，根据Box-Behnken试验设计原理选取超声功率、超声温度、超声时间、液料比4个因素3个水平应用响应面[11～12]分析方法进行单次工艺参数的优化实验，最大程度的对塔拉籽粉进行粗多糖提取。

表1塔拉多糖提取实验因素与水平

Table1Variablesandlevelsinresponsesurfacedesign

因素ElementA提取功率Extractionpower(W)B提取温度Extractiontemperature(℃)C提取时间Extractiontime(min)D料液比Materialliquidratio(g·mL-1)水平Level-130050151∶10035055201∶15140060251∶20

1.2.6 塔拉多糖对ABTS自由基的清除作用

塔拉多糖可以通过捕捉脂质过氧化链式反应中产生的ROS，减少脂质过氧化反应链长度、阻断或减缓脂质过氧化的进行，达到对ROS的直接清除作用；通过与产生ROS所必需的金属离子发生络合作用，对ROS起间接清除作用，多糖环上的OH可与产生OH·等所必需的金属离子络合，使其不能产生启动脂质过氧化的OH·或使其不能分解脂质过氧化产生的脂过氧化物，从而抑制ROS的产生；塔拉多糖还可通过提高SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性，从而发挥抗氧化的作用。

取30 mg ABTS用7.35 mL蒸馏水溶解，配成浓度为7.4 mmol·L-1的ABTS储备液。取10 mg K2S2O2用14.3 mL蒸馏水溶解，配成浓度为2.6 mmol·L-1的K2S2O2储备液。取0.2 mL ABTS储备液和0.2 mL K2S2O2储备液混合，室温条件下避光放置12 h，用蒸馏水稀释40～50倍，在734 nm处测吸光度为0.7左右，即为ABTS+工作液。

取4 mL ABTS+工作液和1 mL无水乙醇混合均匀，振摇10 s，静置5 min后在734 nm处测吸光值A0。取4 mL ABTS+工作液和1 mL多糖样品混合均匀，振摇10 s，静置5 min后在734 nm处测吸光值A。

纯化前和纯化后的多糖样品的质量浓度都分别4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg·mL-1，以VC为阳性对照，测定塔拉多糖对ABTS自由基的清除能力。

Y(%)=[(A0-A)/A0〗×100%

(2)

式中：Y为ABTS自由基清除率(%)；A0为空白样品的吸光度；A为不同质量浓度的被测混合物的吸光度。

50%抑制浓度IC50可通过自由基清除活性—样品浓度的线性关系求出。

2 结果与分析

2.1 塔拉多糖得率回归模型的建立及显著性检验

按照Box-Behnken试验方案进行四因素三水平试验，结果见表2。将所得的实验数据采用Design Expert软件进行多元回归拟合[13]，得到以多糖得率(Y)为目标。

表2 塔拉多糖Box-Behnken提取试验设计与结果

函数的二次回归方程：多糖得率对超声功率A、超声温度B、超声时间C和水料比D的二次多项回归方程：

Y(%)=25.06+1.97A+0.72B-0.13C-1.02D+2.17AB-3.01AC+1.27AD+1.56BC-1.51BD+2.47CD-4.51A2-4.21B2-2.45C2-2.46D2

(3)

式中的超声功率A、超声温度B、超声时间C和料液比D在设计中均经量纲线性编码处理，因此方程中各项系数绝对值的大小直接反映了各因素对指标值的影响程度，系数的正负反映了影响的方向。

表3 方差分析

注：*.差异显著(P<0.05)；**.差异极显著(P<0.01)

Note: *significant difference(P<0.05); **extremely significant difference(P<0.01)

2.2 响应面优化的交互作用

通过响应面优化实验得到各因素之间交互作用的三维立体图，提取功率、温度、时间、料液比的交互作用如图1所示。

从图1a可知多糖得率随超声温度和超声功率的提高呈先上升后下降的趋势，二者交互作用明显，温度越高分子解附和扩散运动速度越快，多糖的析出速度越快，但当温度过高时多糖分子解构，从而得率降低，超声功率越大对细胞壁及细胞膜的破坏作用越强，随着温度的升高，多糖的析出越快，当多糖完全从细胞中溶出后超声功率越大对多糖的结构的破坏力也随之越大，从而降低了多糖得率。

从图1b可知多糖得率随超声功率和超声时间的增大成先上升后下降的趋势，二者有交互作用，水料比一定时，在高温区和低温区的多糖得率较低，主要是因为温度的升高使得分子解附和扩散运动速度加快，从而提高了多糖的析出速率和得率，水料比的增大，使得多糖的浓度更低，更容易从细胞中溶出。

图1 塔拉多糖超声提取的响应曲面图 a.温度和功率的交互作用；b.时间和功率的交互作用；c.料液比和温度的交互作用；d.时间和温度的交互作用Fig.1 Tarapolysaccharide response surface mapping for ultrasonic extraction a. Temperature and power; b. Time power interaction; c. Material liquid than and temperature interaction; d. Time and temperature interactions

从图1c可知多糖得率随料液比和超声温度的提高成先上升后下降的趋势，且二者有明显的交互作用。水料比一定时，在高温区和低温区的多糖得率较低，这主要是因为温度的升高使得分子解附和扩散运动速度加快，从而提高了多糖的析出速率和得率，而温度过高可能会影响破坏多糖结构，降低得率。水料比的增大，使得多糖的浓度更低，更容易从细胞中溶出。

从图1d可知，多糖得率随超声时间的延长和温度的提高呈先上升后下降的趋势，且二者有明显的交互作用。根据提取动力学理论，时间的延长有助于多糖的充分扩散析出，同时温度的升高使得分子解附和扩散运动速度加快，多糖的析出速率和得率提高，因此适当延长时间和提高温度有助于提高多糖得率。而温度过高可能会影响破坏多糖结构，降低得率。

2.3 塔拉多糖最佳提取条件的确定和验证实验

在选取的各因素范围内，根据回归模型通过Design Expert软件分析得出，塔拉多糖最佳提取条件为超声功率363.94 W、超声温度56.27℃、超声时间23.26 min、料液比1∶16.93，多糖的率的预测值为25.71%，考虑到实际操作会出现误差影响,确定塔拉多糖的超声提取条件为超声功率363 W、超声温度56℃、超声时间23 min、料液比1∶17，结果塔拉多糖的得率为25.56%，与预测值相差很小说明该方程与实际情况拟合较好，充分验证了所建模型的正确性，说明响应曲面法适用于对塔拉多糖的超声波提取工艺进行回归分析和参数优化。

2.4 塔拉多糖对ABTS自由基的清除作用

由图2可以看出，以VC为阳性对照，塔拉多糖对ABTS自由基有较强的清除能力。当提纯后的塔拉多糖质量浓度0.125 mg·mL-1时，对ABTS自由基的清除率为17.76%，而提纯前的仅为12.11%，随着多糖质量浓度的增加，对ABTS自由基的清除作用增加，当多糖质量浓度在0.125～4 mg·mL-1范围内增加时，呈现出明显的剂量效应[14～15]，当提纯后塔拉多糖质量浓度为4 mg·mL-1时，对ABTS自由基的清除率达到96.98%，而提纯前的仅为52.09%。同时，塔拉多糖对ABTS自由基清除能力IC50为3.25 mg·mL-1。由此可见，塔拉多糖可以做抗氧化剂，且多糖纯度越高，对ABTS自由基的清除作用越显著[16～17]。

图2 塔拉多糖对ABTS自由基的清除作用Fig.2 Tara polysaccharide scavenging effect on ABTSfree radical

3 结论

利用软件Design Expert进行试验设计，采用响应曲面法建立塔拉多糖提取工艺条件的二次多项式数学模型，对各因素对响应值的影响进行分析。结果表明，模型拟合程度高，实验误差小，最佳的提取工艺条件为超声功率363 W，超声温度56℃，超声时间23 min，料液比1∶17(g·mL-1)，此工艺条件的多糖得率为25.56%，与预测值相差较小。经纯化后塔拉多糖提取率为17.82%，纯度为69.72%。以VC为阳性对照，对不同纯度的塔拉多糖进行抗氧化性的研究，发现其纯度越高，对ABTS自由基的清除能力越强。因此，塔拉多糖作为一种天然的具有抗氧化活性的物质，可进一步开发为天然无副作用的保健品、药物，还可广泛用于纺织、医药、石油，尤其是食品工业中。

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Forestry Public Welfare Industry Research Special(201404616)

introduction：ZHAO Han-Mei(1992—),female,graduate student,Study on plant resources.

date:2017-02-05

OptimizationofUltrasonicExtractionofPolysaccharidesfromTaraSeedandItsAntioxidantActivity

ZHAO Han-Mei YUAN De-Cheng YANG Feng-Jian*

(Key Laboratory of Forest Plant Ecology,Ministry of Education,Northeast Forestry University,Harbin 150040)

For the optimum ultrasonic extraction of Tara polysaccharide,a multiple quadratic regression was stablished using a 4-factor, 3-level Box-Behnken statistical design, and the response surface with the extraction rate of polysaccharides as the response were drawn. The antioxidant activities of Tara polysaccharide invitrowere tested. Theoptimumextractionconditions of Tara polysaccharide were: ultrasonic treatment at 56℃ for 23 min with ultrasonic power 363 W, and material to liquid ratio of 1∶17 g·mL-1. The maximum extraction rate of Tara crude polysaccharides was 25.56%, less than the theoretical deduced value of 25.71%.The purified Tara polysaccharide extraction rate was 17.82%.Using VC as a positive control, the antioxidant activity of different purity Tara polysaccharide was measured, and it was found that its purity was high, and the ABTS radical scavenging ability was stronger.

Tara polysaccharide；extraction；response surface analysis methodology(RSM)；antioxidant activity

林业公益性行业科研专项(201404616)

赵寒梅(1992—)，女，硕士研究生，主要从事植物资源学的研究。

* 通信作者：E-mail:yangfj@nefu.edu.cn

2017-02-05

* Corresponding author：E-mail:yangfj@nefu.edu.cn

Q949.751.9

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.04.021