刚毛柽柳ThDREB基因在酵母中的表达及抗逆能力分析

冯德明 温佩颖 赵 畅 杨远彪 杨桂燕 于丽丽 高彩球*

(1.东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040； 2.东北林业大学帽儿山教学区，尚志 150040)

刚毛柽柳ThDREB基因在酵母中的表达及抗逆能力分析

冯德明1温佩颖1赵 畅1杨远彪2杨桂燕1于丽丽1高彩球1*

(1.东北林业大学林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040；2.东北林业大学帽儿山教学区，尚志 150040)

DREB蛋白能特异地与DRE(dehydration responsive element)顺式作用元件结合，从而调控下游多个与逆境相关基因的表达，在植物对多种逆境胁迫的应答反应中起重要调节作用。为了研究刚毛柽柳ThDREB基因是否具有抗逆功能，将ThDREB基因插入到酵母表达载体pYES2中构建成重组载体，转入酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中获得重组型酵母。分别比较转ThDREB基因酵母和转空载体对照酵母在山梨醇、H2O2、CdCl2、NaCl、Na2CO3、MgCl2、-20℃胁迫处理之后的存活能力。结果显示，ThDREB基因能有效提高转基因酵母的抗干旱、盐、碱、氧化、重金属及低温胁迫的能力，表明ThDREB基因可能参与了柽柳多种抗逆调控过程。

刚毛柽柳；DREB转录因子；酵母表达；非生物逆境抗性

在基因工程育种中，由于调控基因可以激活或抑制多个与抗逆相关功能基因的表达，因此，与转入单个功能基因相比，转入调控基因可能对植物抗逆能力的提高改良效果更好。转录起始调控主要是通过转录因子与基因启动子区域中的顺式元件发生特异性相互作用来调控基因的表达。因此，转录因子得到了人们广泛的关注。

DREB(dehydration responsive element binding protein)转录因子是AP2/ERF转录因子家族的一个亚家族成员。很多研究证明，DREB类转录因子在逆境抗性中起重要作用，转DREB基因植物抗逆能力明显提高。如Peng等[1]从红树(Avicenniamarina)中克隆获得了CBF/DREB1同源基因AmCBF2，发现AmCBF2的表达受冷、干旱、高盐、重金属和脱落酸(ABA)胁迫诱导，表明AmCBF2可能参与冷、干旱和重金属胁迫响应。Xiong和Fei[2]将多年生黑麦草(LoliumperenneL.)DREB基因(LpCBF3)转入拟南芥，转基因拟南芥的抗冻能力明显提高，而且转基因拟南芥中，过量表达的LpCBF3能诱导拟南芥DREB1A/CBF3的目标基因COR基因，COR15a和RD29A的表达，在黑麦草的远源植物拟南芥中表现出转录调控因子功能。绿豆(Vignaradiata)VrDREB2A基因的表达受干旱、高盐和ABA诱导，过表达VrDREB2A基因拟南芥能通过激活下游一些基因的表达增加干旱和高盐胁迫耐受性[3]。荞麦(Fagopyrumesculentum)FeDREB1基因能提高转基因拟南芥的冷冻和干旱胁迫耐性[4]。

刚毛柽柳(Tamarixhispida)是一种灌木或小乔木，具有很强的抗旱、耐盐、耐水湿、抗沙埋能力，是优良的防风固沙、水土保持和盐碱地造林树种[5]。同时，刚毛柽柳也是研究植物抗旱耐盐机制和克隆抗逆基因的理想树种。因此，本研究从刚毛柽柳cDNA文库中克隆到ThDREB基因，将其构建到pYES2中，转化酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，并以转pYES2空载体酵母做对照，比较转基因酵母和对照酵母的抗逆能力。结果显示，与对照酵母相比，转ThDREB基因酵母明显提高了抗旱、耐盐和耐重金属等胁迫的能力。ThDREB基因可能是一个优良的抗逆基因，为进一步通过基因工程手段应用于植物抗逆转基因育种提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1酵母表达载体构建

根据ThDREB基因全长序列和pYES2载体特征设计ThDREB基因酵母表达载体引物，上游引物为ATCGAAGCTTAGCATGGCCTTGTACTATGGCTATC(下划线为HindⅢ酶切位点序列)；下游引物为CGATGGATCCTCAAATAGAATGGCTCCACAATG(下划线为BamHⅠ酶切位点序列)。以两个月生刚毛柽柳根部cDNA为模板，通过RT-PCR扩增获得含有酶切位点的ThDREB基因序列，经HindⅢ和BamHⅠ酶酶切纯化回收后与同样经过HindⅢ和BamHⅠ酶双酶切的酵母表达载体pYES2连接，转化大肠杆菌后，经PCR和测序验证后，获得重组载体pYES2-ThDREB。根据pYES2载体试剂盒说明(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)采用醋酸锂转化法将pYES2-ThDREB转化到酵母株系INVSC1(His-，Leu-，Trp-和Ura-)。随机挑取转化的酵母单菌落(含重组质粒pYES2-ThDREB)扩大培养，分别提取重组酵母DNA和经诱导表达0、24、36和48 h后的RNA，将RNA反转录成cDNA，用ThDREB基因引物进行PCR和RT-PCR扩增，0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测。保存具有目的条带的酵母菌株，标记为INVSC1(pYES2-ThDREB)。同时将空pYES2载体转入INVSC1，作为阴性对照，标记为INVSC1(pYES2)。

1.2 酵母胁迫处理

挑取INVSC1(pYES2)和INVSC1(pYES2-ThDREB)单克隆酵母细胞在SC-Ura液体培养基(含有2%葡萄糖)中，30℃，180 r·min-1震荡培养至OD600=0.5，离心收集菌体，用含有2%半乳糖的SC-Ura液体培养基(诱导培养基)调整OD600=0.4，30℃诱导表达24 h。测量OD600，使INVSC1(pYES2)和INVSC1(pYES2-ThDREB)OD600相等，分别离心收集菌体用于胁迫处理。

对收集的INVSC1(pYES2)和INVSC1(pYES2-ThDREB)菌体分别用5 mol·L-1NaCl处理24 h，2 mol·L-1山梨醇胁迫24 h，-20℃、6% Na2CO3、1% MgCl2、1 mmol·L-1H2O2、1% CdCl2各胁迫处理1 h。将处理后的菌液作10×稀释(分别稀释100，102，103，104，105倍)，取2 μL点在含有2%葡萄糖的SC-Ura固体培养基上，30℃培养48 h后观察酵母生长情况。

此外，将收集的INVSC1(pYES2)和INVSC1(pYES2-ThDREB)菌体分别置于5 mL诱导培养基中胁迫处理，胁迫包括1、2、3、4和5 mol·L-1的NaCl；0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 mol·L-1的山梨醇；1.2%、2.4%、3.6%、4.8%、6.0%的Na2CO3；0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的CdCl2和MgCl2；0.2、0.4、0.6、0.8和1 mmol·L-1的H2O2。30℃条件下摇床振荡培养24 h后测定细胞密度。低温胁迫(-20℃)时，分别对接种于5 mL诱导培养基中的菌体胁迫3、6、9、12或24 h后，在30℃条件下恢复生长9 h(摇床震荡培养)后再测定细胞密度(OD600)。同时对接种在诱导培养基中的两种酵母进行非胁迫处理，30℃震荡培养8、9、10、11和12 h后，测定OD600值。每个实验重复3次。

1.3 数据分析

数据分析使用SPSS软件包(SPSS,Chicago,Illinois,USA)。

2 结果与分析

2.1ThDREB基因酵母表达载体及酵母重组子的获得

通过双酶切、连接将ThDREB基因构建到酵母表达载体pYES2上，转入大肠杆菌后，随机挑取3个大肠杆菌单菌落(含pYES2-ThDREB)，摇菌培养并提取质粒，进行PCR扩增。结果所示，扩增得到了783 bp的特异条带，初步证明目的基因已经成功整合至载体pYES2中(图1A)。

用HindⅢ和BamHⅠ两种限制性内切酶对上述PCR检测为阳性的重组质粒(pYES2-ThDREB)进行双酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示双酶切后的两个片段与目的基因和载体片段大小一致，表明目的基因已正确连接至pYES2载体，成功构建了ThDREB基因酵母表达载体(图1B)。

随机挑取转化的酵母单菌落(含重组质粒pYES2-ThDREB)扩大培养，提取酵母DNA，进行PCR扩增，0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段与目的基因长度一致，表明重组质粒(pYES2-ThDREB)已经转入酵母INVSc1，成功的获得了酵母重组子INVSC1(pYES2-ThDREB)(图1C)。

图1 重组质粒(pYES2-ThDREB)检测和重组酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)鉴定 A.重组质粒pYES2-ThDREB PCR电泳图谱；B.重组质粒pYES2-ThDREB双酶切产物电泳图谱；C.重组酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)PCR产物电泳图谱；D.重组酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)RT-PCR产物电泳图谱 M. DNA marker DL2000Fig.1 Identification of recombined plasmid and recombinant INVSc1 A. Electrophoresis of recombinant plasmid pYES2-ThDREB PCR; B. Electrophoresis of recombinant plasmid pYES2-ThDREB double enzyme digestion products; C. Electrophoresis of recombinant yeast INVSC1(pYES2-ThDREB) PCR products; D. Electrophoresis of recombinant yeast INVSC1(pYES2-ThDREB) RT-PCR products M. DNA Marker DL2000

进一步利用RT-PCR分析了重组酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)经诱导表达24、36和48 h后外源基因ThDREB的表达情况。结果表明，经2%半乳糖诱导表达后，外源基因ThDREB成功表达，且诱导24 h后ThDREB基因的表达水平较高，因此重组酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)可以用于后续的胁迫实验，且诱导时间为24 h。

2.2逆境胁迫下重组酵母INVSc1(pYES2-ThDREB)生长比较

为研究ThDREB基因的抗逆功能，将重组酵母菌和对照酵母菌分别诱导培养24 h后进行非生物逆境胁迫实验(图2)。结果显示，非胁迫条件下，重组酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)和对照酵母INVSC1(pYES2)的生长状况基本一致，表明ThDREB基因的转入对酵母生长无明显影响，两种酵母的胁迫初始浓度及生长速度一致(图2A)。而在胁迫条件下，两种酵母的生长明显不一致。具体的说，在盐胁迫(NaCl和MgCl2)和盐碱胁迫(Na2CO3)条件下，重组酵母的生长明显优于对照酵母，并且随着稀释倍数扩大，二者的差异也更加显著(图2)，表明ThDREB基因的表达明显增强酵母细胞的耐盐和盐碱胁迫的能力(图2)。而在山梨醇胁迫、H2O2胁迫、重金属CdCl2胁迫和冷胁迫(-20℃)下，转基因酵母的存活率也明显高于对照酵母，尤其是稀释105倍时，对照酵母无一存活，而重组酵母仍有相对较高的存活率(图2)；表明ThDREB基因的表达除了提高转基因酵母细胞的耐盐、碱能力外，还能明显提高转基因酵母的抗旱、耐重金属、氧化以及抗低温胁迫等能力，ThDREB基因的表达提高了重组酵母细胞的多重抗逆能力。

图2 重组酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)和对照酵母INVSC1(pYES2)在不同胁迫条件下生长状况对比Fig.2 The compared of growth between INVSC1(pYES2-ThDREB) and INVSC1(pYES2) under different treatments

图3 不同胁迫下重组酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)和对照酵母INVSC1(pYES2)OD600值比较Fig.3 The compared of growth activity(OD600 ) beween of INVSC1(pYES2-ThDREB) and INVSC1(pYES2) under different treatments

2.3逆境胁迫下重组酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)成活率比较

为了进一步的定量比较重组酵母和对照酵母在逆境胁迫下的生长情况，测定了不同浓度或不同胁迫时间后的重组酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)和对照酵母INVSC1(pYES2)的OD600值(图3)。结果同图2，在非胁迫条件下，各时间点的对照酵母和重组酵母OD600值无显著差异，而两种酵母在实验所选的几种胁迫(NaCl、MgCl2、山梨醇、CdCl2、NaCO3、H2O2、-20℃)处理后，随着胁迫浓度的增加或胁迫时间的延长OD600值都逐渐减小，但在同一胁迫浓度或胁迫时间，重组酵母的INVSC1(pYES2-ThDREB)的OD600值明显高于对照酵母INVSC1(pYES2)的OD600值，且在大部分胁迫时间点或胁迫浓度差异达到显著水平(P<0.05，图中*表示)。表明重组酵母INVSC1(pYES2-ThDREB)对各种逆境胁迫的抗性明显高于对照酵母，ThDREB基因能提高重组酵母的多重抗逆能力。

3 讨论

DREB蛋白能特异地与DRE(dehydration responsive element)顺式作用元件结合，从而调控下游多个与逆境相关基因的表达。因此，DREB类转录因子在植物对多种逆境胁迫的应答反应中起重要调节作用。如李墨野等[6]对干旱胁迫下转LbDREB基因和对照大青杨生长量、保护酶、丙二醛含量、脯氨酸含量及相对电导率等进行测定，证实LbDREB基因提高了转基因大青杨的抗旱能力。侧金盏花(Adonisamurensis)AaDREB1基因能特异的结合DRE/CRT元件，其表达受盐、干旱、冷和脱落酸的诱导，转AaDREB1基因拟南芥和水稻明显增强了盐、干旱和低温胁迫耐受性[7]。Liu等[8]从桑树中克隆获得了一个A4亚家族DREB基因(MnDREB4a)。热、冷、干旱、盐胁迫下，MnDREB4a基因启动子能直接启动下游的β-葡萄糖醛酸酶(GUS)基因的表达，且胁迫12 h后GUS染色变深。过表达MnDREB4a基因烟草明显提高了热、冷、干旱和盐胁迫耐受性。

酵母表达系统是一种快速地了解基因胁迫响应功能的有效系统。如Yang等[9]通过将柽柳金属硫蛋白ThMT3转入酵母细胞证实该基因提高了Cd2+、Zn2+、Cu2+和NaCl胁迫耐受性。Zhou等[10]也在酵母中研究了日本鸢尾液泡膜H+-ATPase C亚基基因的功能。Gao等[11]通过比较逆境胁迫后转基因和对照酵母的存活率证实ThVHAc1基因能提高山梨醇、冷、NaCl、Na2CO3、MgCl2、H2O2和CdCl2等胁迫耐受性。进一步，Yang等[12]证实ThVHAc1基因明显提高了转基因拟南芥和柽柳CdCl2胁迫耐受性。Li等[13]从齿肋赤藓(SyntrichiacaninervisMitt)中克隆获得了10个A-5DREB亚家族基因(ScDREB1～10基因)，其中6个ScDREB基因(ScDREB1、ScDREB2、ScDREB4、ScDREB6、ScDREB7和ScDREB8)参与ABA依赖的信号通路和干旱、盐、冷胁迫响应。ScDREB3也对干旱、盐和冷胁迫应答，但对ABA不敏感。而ScDREB5基因参与了非ABA依赖的冷胁迫应答信号转导通路。ScDREB9和ScDREB10对各胁迫因子或ABA处理略有或无应答。其中的4个ScDREB基因转入酵母结果表明，ScDREB3和ScDREB5提高了酵母的耐盐和冷胁迫能力。ScDREB8和ScDREB10提高了转基因酵母的渗透、盐、冷和高温胁迫等多重耐受性，尤其是提高了渗透胁迫和盐胁迫耐受性。同样，本研究中转ThDREB基因酵母系统初步证实柽柳ThDREB基因能提高酵母多重抗逆性，因此我们推测ThDREB基因可能具有多种抗性。在后续研究中，我们将ThDREB基因转入植物中，分析转基因植物的抗逆能力，并进一步对该基因的上游调控机制、对下游基因的表达调控等方面进行研究，以了解ThDREB基因的抗逆调控机制。

1.Peng Y L,Wang Y S,Cheng H,et al.Characterization and expression analysis of three CBF/DREB1 transcriptional factor genes from mangroveAvicenniamarina[J].Aquatic Toxicology,2013,140-141C(1):68-76.

2.Xiong Y,Fei S Z.Functional and phylogenetic analysis of a DREB/CBF-like gene in perennial ryegrass(LoliumperenneL.)[J].Planta,2006,224(4):878-888.

3.Chen H,Liu L,Wang L,et al.VrDREB2A,a DREB-binding transcription factor fromVignaradiata,increased drought and high-salt tolerance in transgenicArabidopsisthaliana[J].Journal of Plant Research,2016,129(2):263-73.

4.Fang Z W,Zhang X H,Gao J F,et al.A Buckwheat(Fagopyrumesculentum) DRE-Binding transcription factor gene,FeDREB1,enhances freezing and drought tolerance of transgenicArabidopsis[J].Plant Molecular Biology Reporter,2015,33(5):1510-1525.

5.张道远,杨维康,潘伯荣,等.刚毛柽柳群落特征及其生态、生理适应性[J].中国沙漠,2003,23(4):446-451.

Zhang D,Yang W,Pan B,et al.Characters ofTamarixhispidaWilld communities and its ecological & physiological adaptation[J].Journal of Desert Research.2003,23(4):446-451.

6.李墨野,王娜,周宇,等.干旱胁迫条件下转LbDREB基因大青杨瞬时基因表达及生长,生理指标变异分析[J].植物研究,2016,36(3):409-415.

Li M Y,Wang N,Zhou Y,et al.Variation analysis of transient gene expression and growth,physiological indicators under drought stress in expressedLbDREBPopulusussuriensisKom[J].Bulletin of Botanical Research,2016,36(3):409-415.

7.Zong J M,Li X W,Zhou Y H,et al.The AaDREB1 transcription factor from the cold-tolerant plantAdonisamurensisenhances abiotic stress tolerance in transgenic plant[J].International Journal of Molecular Sciences,2016,17(4):611.

8.Liu X Q,Liu C Y,Guo Q,et al.Mulberry transcription tactor MnDREB4A confers tolerance to multiple abiotic stresses in transgenic tobacco[J].PloS One,2015,10(12):e0145619.

9.Yang J,Wang Y,Liu G,et al.Tamarixhispidametallothionein-like ThMT3,a reactive oxygen species scavenger,increases tolerance against Cd2+,Zn2+,Cu2+and NaCl in transgenic yeast[J].Molecular Biology Reports,2011,38(3):1567-1574.

10.Zhou A,Wu D,Liu S,et al.Cloning of vacuolar H+-ATPase subunit c genes from Japanese iris,and functional characterization in yeast[J].Journal of Forestry Research,2011,22(3):361-366.

11.Gao C,Wang Y,Jiang B,et al.A novel vacuolar membrane H+-ATPase c subunit gene(ThVHAc1) fromTamarixhispidaconfers tolerance to several abiotic stresses inSaccharomycescerevisiae[J].Molecular Biology Reports,2011,38(2):957-963.

12.Yang G,Wang C,Wang Y,et al.Overexpression ofThVHAc1 and its potential upstream regulator,ThWRKY7,improved plant tolerance of Cadmium stress[J].Scientific Reports,2016,6:18752.

13.Li H,Zhang D,Li X,et al.Novel DREB A-5 subgroup transcription factors from desert moss(Syntrichiacaninervis) confers multiple abiotic stress tolerance to yeast[J].Journal of Plant Physiology,2016,194:45-53.

National-level College Students’ Innovative Entrepreneurial Training Plan Program(20151022507) and the Scientific Research Fund of Heilongjiang Provincial Education Department(No.12523017).

introduction：FENG De-Ming(1995—),female,undergraduate,mainly engaged in the study of forest tree genetic and breeding.

date:2016-06-21

ExpressionandStressToleranceCharaterizationofaThDREBGenefromTamarixhispidainYeast

FENG De-Ming1WEN Pei-Ying1ZHAO Chang1YANG Yuan-Biao2YANG Gui-Yan1YU Li-Li1GAO Cai-Qiu1*

(1.Northeast Forestry University,State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding,Harbin 150040；2.The Maoershan Teaching Area of Northeast Forestry University,Shangzhi 150040)

DREB protein could specifically bind to DRE(dehydration responsive element) cis-acting elements, and regulate the expression of downstream stress related gene. It plays an important role in the regulation responses of plants to abiotic stress. To explore the abiotic stress tolerance role ofDREB(ThDREB) fromTamarixhispida, the recombinant plasmid(named aspYES2-ThDREB) was constructed by inserting theThDREBgene into the yeast expression vector pYES2. The plasmidpYES2-ThDREBwas transformed into the yeastSaccharomycescerevisiae, and the yeast transformed with empty pYES2 was used as the control. ThepYES2-ThDREBandpYES2 recombinant yeast were treated with sorbitol, H2O2, CdCl2, NaCl, Na2CO3, MgCl2, and -20℃, respectively. ThepYES2-ThDREBrecombinant yeast was tolerant to all above abiotic treatments, suggesting thatThDREBmaybe an important stress-regulating genes inT.hispida.

Tamarixhispida;DREB;yeast expression;abiotic stress tolerance

大学生创新实验训练项目(201510225071)；黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12523017)

冯德明(1995—)，女，本科，主要从事林木遗传育种研究。

* 通信作者：E-mail：gaocaiqiu@nefu.edu.cn

2016-06-21

* Corresponding author：E-mail：gaocaiqiu@nefu.edu.cn

S793.5

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.01.009