杜仲MVA和MEP途径相关基因的亚细胞定位与表达分析

王 淋 杜红岩 乌云塔娜*

(1.中国林业科学研究院经济林研究开发中心，郑州 450003； 2.国家林业局杜仲工程技术研究中心，郑州 450003)

杜仲MVA和MEP途径相关基因的亚细胞定位与表达分析

王 淋1,2杜红岩1,2乌云塔娜1,2*

(1.中国林业科学研究院经济林研究开发中心，郑州 450003；2.国家林业局杜仲工程技术研究中心，郑州 450003)

通过对杜仲基因组分析，筛选并克隆出MVA途径和MEP途径的相关基因全长(EuDXR，EuMCT，EuCMK，EuMDS，EuACOT，EuHMGS和EuHMGR)，并通过生物信息学方法分析其结构特征，结果表明上述基因与其他已知物种相应基因的相似度达73%～85%。通过构建亚细胞定位表达载体，并瞬时转化烟草下表皮细胞后激光共聚焦显微镜下观察显示，EuDXR，EuMCT，EuCMK，EuMDS基因编码蛋白定位于叶绿体，EuACOT和EuHMGR基因编码蛋白定位于内质网，EuHMGS基因编码蛋白定位于细胞质膜。利用转录组测序技术分析上述基因的时空表达特性表明，MEP途径相关基因在杜仲叶片中大量表达，而MVA途径相关基因在杜仲幼果中大量表达，且杜仲幼果比叶片中的橡胶含量高，因此，推断MVA途径在杜仲橡胶合成中占主导作用。

杜仲；MVA途径；MEP途径；亚细胞定位；表达分析

杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)是我国特有的名贵药用树种，也是除三叶橡胶外唯一具有巨大开发前景的优质天然胶资源[1]。杜仲叶片、果皮、根、树皮都含有一种白色丝状物质杜仲橡胶(EucommiaulmoidesRubber，EU-Rubber)[2]。作为一种优质的天然橡胶资源，杜仲橡胶具有独特的结构与性能，可以开发出各种不同用途的新型工业材料，广泛应用于橡胶工业、航空航天、军工、船舶、化工、医疗等多个领域[3]。

杜仲橡胶是反式聚异戊二烯，它的生物合成与其它植物的类异戊二烯次生代谢途径基本相同，是一种典型的植物类异戊二烯的次生代谢途径[4]。杜仲橡胶是在一种特殊的异戊烯基转移酶作用下将低分子量反式异戊二烯不断缩合而形成的，而低分子量异戊二烯的生物合成则是通过类异戊二烯合成所必须的前体物质异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)的不断缩合而形成。IPP与DMAPP的生物合成主要基于甲羟戊酸(Mevalonate,MVA)途径和丙酮酸/磷酸甘油醛途径(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate,MEP)途径两条途径[5～6]。植物中的MVA途径和MEP途径基因的表达以及酶的活性对提高萜类合成前体和下游萜类产物的表达量均有一定的影响[7]。研究表明，l-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸经l-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶(DXR)作为MEP途径的第一个关键酶，在植物细胞中的含量可以影响植物萜类物质的合成[8]。在三叶橡胶中，HbDXR2基因的大量表达，并与橡胶产量密切相关[9]。乙酰CoA在乙酰乙酰CoA硫解酶(ACOT)是MVA途径的起始酶,对众多蛋白的酰基化及去酰基化起催化作用[10～11]。拟南芥中有两种不同的乙酰基转移酶,其中AtACOT2的在拟南芥中的相对表达量较高，AtACOT2为萜类物质合成关键酶，对异戊二烯的生物合成有关键作用[12]。另外，通过调节三叶橡胶MVA途径中的3-羟基-3-甲基戊二酰CoA合成酶(HMGS)和3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(HMGR)酶的活性，可以影响天然橡胶的生物合成[12,14]。

果用杜仲良种‘华仲6号’，该良种果实产胶量高、适应性强、嫁接成活率高、抗干旱,是当前推广的重要类型[15]。本研究以‘华仲6号’杜仲果实为试验材料，对杜仲MVA途径和MEP途径相关基因进行克隆，通过构建瞬时表达载体，转化烟草下表皮细胞的方法对上述基因编码蛋白进行亚细胞定位，利用转录组测序技术研究其在叶片、幼果和成熟果实中的表达特性，探讨MVA途径和MEP途径相关基因对杜仲橡胶生物合成的基因机制，为进一步研究杜仲生长发育过程中MVA途径和MEP途径代谢调控奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

杜仲MVA途径和MEP途径基因的克隆研究所用材料采自于中国林业科学研究院经济林研究开发中心杜仲良种‘华仲6号’；杜仲转录组测序材料为幼果(授粉后50 d，5月28日)、成熟果(授粉后210 d，10月28日)和叶片(展叶后55 d，5月28日)。样品采集后迅速放入液氮冷冻，后移至-80℃超低温冰箱保存备用。

1.1.2 菌株和质粒

大肠杆菌菌株(E.coli)DH5α感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司；克隆载体pMD-18 T Vector购自Takara公司；Gateway中间载体pDNOR222.1及Gateway表达载体pEarleyGate 101和pEarleyGate 104以及农杆菌菌株(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101均由中国林业科学研究院林木遗传育种国家重点实验室惠赠。

1.1.3 酶及生化试剂

植物RNA提取试剂盒(RNeasy Plant mini Kit)购自QiAgen公司；cDNA第一链合成SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis System购自Inviterogen公司；PCR相关试剂以及凝胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒购自Axygen公司；HindⅢ等各种限制性内切酶购自NEB公司；其他试剂为国产分析纯试剂；引物合成及测序均由Invitrogen生物技术有限公司和中美泰和生物技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 目的基因的克隆与分析

1.2.1.1 总RNA的提取以及cDNA第一链的合成

选取生长良好的‘华仲6号’植株，以其幼嫩叶片为材料，根据QiAgen公司RNA提取试剂盒(RNeasy Plant mini Kit)说明书步骤进行操作。cDNA第一链合成根据Inviterogen公司的SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis System反转录试剂盒说明书步骤进行操作。

1.2.1.2 目的基因的克隆

通过对杜仲的全基因组以及转录组测序数据的分析，筛选出杜仲MVA途径和MEP途径相关酶基因，根据这些相关酶基因的序列，设计基因特异性扩增引物(表1)。

表1 引物序列及用途

以杜仲RNA反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR扩增体系如下：100 ng·μL-1cDNA 1 μL，10 U·μL-1Taq酶25 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 22 μL。PCR扩增条件为，98℃ 4 min预变性，98℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 120 s，35个循环，72℃延伸10 min。扩增得到的产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析，得到预期大小的片段，切胶回收，连接到pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，进行测序。

1.2.1.3 生物信息学分析

利用BLASTn和BLASTp对得到的核苷酸序列及推导的氨基酸序列进行序列相似性分析。利用ExPASyProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)程序与ScanProsite(http://prosite.expasy.org/)程序对EuDXR，EuMCT，EuCMK，EuMDS，EuACOT，EuHMGS和EuHMGR基因的氨基酸残基数、蛋白质相对分子量、理论等电点以及蛋白质的亲疏水性等性质进行了预测与分析；利用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和WoLF PSORT(http://www.genscript.com/wolf-psort.html)程序预测上述基因的蛋白质跨膜结构域和亚细胞定位。

1.2.2 亚细胞定位

1.2.2.1 载体的构建

本文采用Gateway方法构建亚细胞定位载体。根据Gateway方法载体构建要求，分别设计带有Gateway接头的基因序列扩增特异性引物(表1，下划线部分为Gateway接头序列)，以上述克隆得到的质粒为模板，进行PCR扩增。Gateway PCR克隆反应条件为：98℃预变性1 min；98℃变性10 s，55℃退火15 s，68℃延伸2 min，8个循环；98℃变性10 s，68℃延伸2 min，32个循环；68℃延伸10 min。产物回收后，根据Gateway BP Clonase Enzyme Mix试剂盒说明书进行操作(图1)，连接入门载体。随后，将构建成功的入门载体质粒用XbaⅠ酶限制性内切酶酶切，将线性化酶切产物按照Gateway LR Clonase Enzyme Mix试剂说明书进行LR重组反应，从而将目的片段亚克隆进入表达载体并进行载体质粒酶切检测。

图1 杜仲MVA和MEP途径相关基因的亚细胞定位表达载体构建示意图Fig.1 Constructing subcellular localization expression vector of gene in MVA and MEP pathway

1.2.2.2 烟草瞬时表达转化

将构建35S驱动下含有YFP的融合表达载体质粒转化农杆菌GV3101后，于LB培养基中28℃摇培，离心重新悬浮后，利用注射器吸取少量重悬的农杆菌液，将菌液注入到烟草叶片的下表皮细胞中，黑暗下放置培养6 h后放到正常光照下培养(22℃，光照16 h，黑暗8 h)后，于激光共聚焦显微镜下观察荧光信号在烟草表皮细胞内的分布。

1.2.3 相关基因表达量的分析

杜仲不同时期不同组织的样品转录组测序工作由深圳华大公司完成。根据测序结果对Unigene的分析和注释，筛选出杜仲MVA和MEP途径相关基因，并确定其表达量。

2 结果与分析

2.1 杜仲MEP和MVA途径基因克隆及序列分析

将杜仲总RNA反转录成的cDNA，以cDNA为模板，利用表1特异引物进行全长cDNA的PCR扩增，从而得到目的片段，进行回收测序，分别获得杜仲EuDXR，EuMCT，EuCMK，EuMDS，EuACOT，EuHMGS和EuHMGR7个基因的全长CDS(图2)。

图2 杜仲MVA和MEP途径相关基因的RT-PCR扩增 M.分子量标准；1～7.EuDXR,EuMCT,EuCMK,EuMDS,EuACOT,EuHMGS,EuHMGR扩增结果Fig.2 RT-PCR amplification of the related genes in MVA and MEP pathway M. Marker; 1-7. Amplification result of EuDXR,EuMCT,EuCMK,EuMDS,EuACOT,EuHMGS,EuHMGR,EuHMGR

利用BLAST进行核苷酸相似性检索后发现，杜仲EuDXR，EuMCT，EuCMK，EuMDS，EuACOT，EuHMGS和EuHMGR基因核苷酸序列与其他物种中相应基因具有较高的相似性，说明克隆的基因为杜仲EuDXR(KX431565)，EuMCT(KX431566)，EuCMK(KX431567)，EuMDS(KX431568)，EuACOT(KX431569)，EuHMGS(KX431570)和EuHMGR(KX431571)，7个基因cDNA的长度分别为分别1 437、960，1 185、711、1 245、1 401、1 773 bp分别编码478、319、394、236、414、466、590aa个氨基酸。杜仲EuDXR与茶树(KM255119)，枇杷(JX089590)和苹果(XM_008394812)的同源性较高，相似性均为82%；杜仲EuMCT与帽柱木(JF412813)，芝麻(XM_011089302.)和油橄榄(JX266166)的同源性较高，分别为85%，84%，84%；杜仲EuCMK与葡萄(XP_002267319.2)，长春花(ABI35992.1)和丹参(ABP96842.1)的同源性较高，分别为78%，77%，75%；杜仲EuMDS与毛果杨(XP_002304519.1)，橡胶(AAS94122.1)和丹参(AEZ55667.1)的同源性较高，分别为，73%，73%，74%；杜仲EuACOT与茶树(JQ390224)，金盏菊(KC439366.1)，喜树(EU677841)和葡萄(FQ383761)的同源性较高，分别为，85%，85%，84%，83%；杜仲EuHMGS与茶树(JQ390224)，三七(KP702301)和长春花(JF739871)的同源性较高，分别为85%，83%，82%；杜仲EuHMGR与芝麻(XM_011075756)，胡杨(XM_011039799)，巨桉(XM_010062927)和雷蒙德氏棉(XM_012624452)的同源性较高，分别为79%，78%，77%，76%。对上述7个蛋白的理化性质进行分析(表2)。

表2 MVA途径和MEP途径相关基因的基本理化性质参数

2.2杜仲MEP和MVA途径基因基因编码蛋白的亚细胞定位

为确定相关基因表达的蛋白在细胞中发挥功能的具体位置，构建了黄色荧光蛋白(YFP)与目的基因的融合表达载体。本研究将EuDXR、EuMCT、EuCMK、EuMDS、EuACOT，EuHMGS和EuHMGR基因完整编码区分别插入到花椰菜花叶病毒35S强启动(CaMV35S)和YFP(Yellow Fluorescent Protein)荧光蛋白基因之间形成融合蛋白基因，7个基因的融合表达载体构建完成以后，对载体目标区域进行测序验证，插入片段与预期序列完全一致，表明载体构建成功。随后，转化到烟草下表皮细胞中，并获得高效瞬时表达。在激光共聚交显微镜下观察的荧光信号，结果发现，将含有EuDXR-YFP，EuMCT-YFP，EuCMK-YFP和EuMDS-YFP，农杆菌一起注射烟草下表皮细胞，构成瞬时表达，在激光共聚交显微镜下观察的荧光信号发现EuDXR，EuMCT，EuCMK和EuMDS与叶绿体自发荧光信号相重合，说明EuDXR，EuMCT，EuCMK和EuMDS基因所编码的蛋白定位与叶绿体上(图3)。

将含有内质网标记荧光蛋白GFP-HDEL与EuACOT-YFP和EuHMGR-YFP的农杆菌一起注射烟草下表皮细胞，构成瞬时表达，在激光共聚交显微镜下观察的荧光信号发现EuACOT和EuHMGR的YFP荧光信号与GFP-HDEL标记的内质网区域的荧光信号相重合，说明EuACOT和EuHMGR基因所编码的蛋白定位于内质网上(图4:A～B)。另外，用2 μmol·L-1FM4-64染色含有EuHMGS-YFP的烟草叶片，5 min后，在激光共聚焦显微镜观察，发现EuHMGS的的YFP荧光信号与FM4-64所染色的细胞质膜的信号相重合，说明EuHMGS基因所编码的蛋白定位于细胞质膜上(图4C)。

2.3杜仲MEP和MVA途径相关基因时空表达分析

为了解杜仲橡胶合成的MEP和MVA途径相关基因在杜仲不同组织器官中的时空表达特性，本研究对不同生长发育阶段的杜仲不同组织进行了转录组测序。根据杜仲萜类物质合成的转录数据，分析了EuDXR、EuMCT、EuCMK、EuMDS、EuACOT和EuHMGR基因在杜仲幼果、成熟果实和叶片中的表达。结果显示，上述7个基因在杜仲果实和叶片中均有表达，但表达量不同。MEP途径基因在杜仲幼果和成熟果实中的表达(图5)，除了EuDXR基因，EuMCT、EuCMK、EuMDS基因在幼果中的表达量大于成熟果实，MVA途径基因在杜仲幼果和成熟果实中的表达(图6)，EuACOT，EuHMGS和EuHMGR基因在幼果中的表达量均大于成熟果实，且MVA途径EuACOT，EuHMGS和EuHMGR基因的在幼果时期的表达量远远高于其在成熟果实时期的表达。

图3 MEP途径基因在烟草下表皮细胞中的亚细胞定位 A～D. EuDXR-YFP，EuMCT-YFP，EuCMK-YFP和EuMDS-YFP融合蛋白的表达 红色为叶绿体自发荧光Fig.3 Subcellular localization of MEP pathway in tobacco lower epidermal cells A-D. Confocal images of epidermal leaf cells expressing EuDXR-YFP，EuMCT-YFP，EuCMK-YFP and EuMDS-YFP The red channel shows autofluorescence of chlorophyll in photosynthetic tissues.

图5 MEP途径相关基因在幼果和成熟果实中的表达差异Fig.5 Difference expression of gene in young fruit and fruit

图6 MVA途径相关基因在幼果和成熟果实中的表达差异Fig.6 Difference expression of gene in young fruit and fruit

MEP途径基因在杜仲幼果和叶片中(图7)，位于MEP途径的EuDXR、EuMCT、EuCMK和EuMDS基因，在叶子中的表达量大于幼果。MVA途径基因在杜仲幼果和叶片中(图8)，位于MVA途径中的EuACOT，EuHMGS和EuHMGR基因在幼果中的表达量大于叶子，其中EuHMGS和EuHMGR基因的在幼果中的表达远远大于叶子。

图7 MEP途径相关基因在叶片和幼果中的表达差异Fig.7 Difference expression of gene in leaves and young fruit

图8 MVA途径相关基因在叶片和幼果中的表达差异Fig.8 Difference expression of gene in leaves and young fruit

3 讨论

植物萜类化合物在植物生物生命活动中具有重要的作用，并被广泛的应用于工业生产和医药卫生。尽管萜类化合物的结构和功能多样，但它们都是由共同的结构前体物质合成[16]。合成植物萜类前体的两条途径分别为MVA途径和MEP途径，而且这两条途径所涉及到的基因和酶也完全不同[17]。目前，MVA途径和MEP途径相关基因的功能已经广泛被报道，但是关于杜仲MVA途径和MEP途径相关基因的克隆和功能分析非常有限。本研究从杜仲叶片中克隆了EuDXR，EuMCT，EuCMK，EuMDS，EuACOT，EuHMGS和EuHMGR基因的全长，分析结果显示，这7个基因的蛋白序列与其他植物的相应蛋白序列高度相似。因此说明杜仲MVA途径和MEP途径相关基因的成功克隆将有助于深入研究它们的功能及其在杜仲橡胶生物合成中的作用。

尽管植物中的MVA途径和MEP途径相关基因相对保守，但同一物种的不同品种间的同源基因也会在核苷酸和氨基酸序列上产生变化，这些基因是否都具备与其同源基因类似的功能需要进一步的研究[18～19]。另外，基因表达的产物蛋白质是在生命活动真正起作用的是生物功能的直接体现者。蛋白质位于细胞的不同部位所行使的功能不同，蛋白质的定位对于明确其功能和参与的代谢途径有着非常重要的作用，因此对于蛋白质进行亚细胞定位也是对其功能进行分析研究必要环节之一[20～21]。为了确定杜仲MVA途径和MEP途径相关基因但在细胞中的定位，本研究首次以杜仲‘华仲6号’为试验材料，通过YFP标记方法研究了EuDXR，EuMCT，EuCMK，EuMDS，EuACOT，EuHMGS和EuHMGR7个基因的亚细胞定位特性。研究结果表明，EuDXR，EuMCT，EuCMK和EuMDS与YFP融合蛋白均定位于叶绿体上，说明EuDXR，EuMCT，EuCMK和EuMDS为叶绿体蛋白，对叶绿体及光合作用过程中的具有重要的作用，定位分析结果与MEP途径位于质体相吻合。EuACOT和EuHMGR与YFP融合蛋白均定位于内质网上，而EuHMGS与YFP融合蛋白定位于细胞质膜上，膜上的蛋白质主要有载体蛋白、与细胞活动相关的离子泵、通道蛋白和蛋白受体等，EuHMGS基因所编码的蛋白定位与细胞质膜上表明该基因对细胞质膜的稳定和控制蛋白转运具有一定的作用[22～23]。

反式聚异戊二烯合成主要是通过MEP和MVA两个途径完成的，但这两条途径并不是完全孤立的，可以通过质体膜上进行代谢物质的交换[17,24]。Bamba等人认为MEP和MVA没有严格的空间限制，而是两途径间存在着代谢流动和交流，且两条途径均能为萜类物质的合成提供前体物质IPP来合成长链反式橡胶，但是MEP和MVA两条途径分别对萜类物质合成的贡献量大小尚不清楚[25]。在三叶橡胶的研究中认为聚异戊二烯生物合成所需要的IPP只来自于MVA途径，但在杜仲橡胶的研究中认为聚异戊二烯生物合成所需要的IPP既来自于MVA途径，又来自于MEP途径[26]。日本学者通过对杜仲茎周围组织的EST文库分析发现，MVA途径的相关基因均在cDNA文库被检测到；而MEP途径相关基因仅检测到DXP合成酶基因，说明茎中MVA途径主导着IPP的生物合成，推测茎中反式异戊二烯橡胶所需的IPP主要来自于MVA途径[27]。本研究在杜仲不同生长发育时期的叶片和果实中均能够检测到MVA和MEP途径相关基因的表达，不同的基因在不同时期、不同组织的表达量不尽相同，具有组织表达特异性，这可能与不同组织细胞中所含细胞器类型密切相关。杜仲MVA途径中的基因主要在杜仲幼果中大量表达，而MEP途径的基因主要在杜仲叶片中大量表达。不同的组织，杜仲橡胶的含量也有所不同，一般杜仲树皮、根皮、叶片和果实的橡胶含量分别为8%～12%，5%～10%，2%～6%和13%～20%[28～32]。因此，在缺少叶绿体的器官如果实、根皮和树皮等的橡胶含量远大于叶片的橡胶含量，说明杜仲橡胶的合成与叶绿体细胞相关基因表达可能无必然联系，可能多参与其他萜类物质合成，如类胡萝卜素等，而前体物质IPP可能主要经由MVA途径合成，并结合下游相关酶基因的共同作用下完成杜仲橡胶的合成。另外，杜仲橡胶的合成是一个积累的过程，不同的生长发育阶段，杜仲橡胶的含胶增长速率不断的发生变化[33]。杜仲果实含胶增长速率在4月中旬至5月中旬含胶量快速增长，含胶增长速率达到最大，高于同期叶片的含胶量和增长速率[15,34]。加之杜仲MVA途径相关基因在幼果时期大量表达，因此，杜仲MVA途径基因的表达与杜仲橡胶增长速率相一致，具有一定的相关性，进一步说明MVA途径在杜仲橡胶合成中占有主导地位。综上所述，本研究对7个完整的MVA途径和MEP途径相关基因的亚细胞定位和表达情况做了一定的研究，为进一步研究MVA途径和MEP途径相关基因的功能奠定一定的基础。

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Twelve-five science and technology support program(2012BAD21B0502);Forestry industry research special funds for public welfare projects(201004029)

introduction：WANG Lin(1986—),female,Doctor,mainly engaged in the study of Non-timber forest breeding.

date:2016-06-28

SubcellularLocalizationandExpressionAnalysisofGenesfromEucommiaulmoidesInvolvedinMVAandMEPPathway

WANG Lin1,2DU Hong-Yan1,2WUYUN Ta-Na1,2*

(1.Non-timber Research and Development Center,Chinese Academy of Forestry,Zhengzhou 450003；2.The Eucommia Engineering Research Center of State Forestry Administration,Zhengzhou 450003)

The full-long ofEuDXR,EuMCT,EuCMK,EuMDS,EuACOT,EuHMGSandEuHMGRgenes were isolated fromEucommiaulmoides. The structure characteristics were analyzed by using bioinformatics, which revealed that these deduced proteins had 73%-85% identities with the corresponding protein from other plants. Recombinant plasmid was introduced into the lower epidermal leaf explants of tobacco, and the transient expression of these genes with GFP fusion protein were observed with a Zeiss LSM. The subcellular localization analysis showed that theEuDXR,EuMCT,EuCMK,EuMDSprotein were all located in the chlorophyll,EuACOTandEuHMGRprotein were both located in the endoplasmic reticulum,EuHMGSprotein was located in the plasma membrane. By RNA sequencing, the spatial-temporal expression patterns of these genes were detected. The expression of genes in MEP pathway is higher in leaves, but the expression of genes in MVA pathway is higher in young fruit. The rubber content in young fruit was higher than that in leaves. Therefore, the MVA pathway played a dominant role in the biosynthesis of Eu-rubber.

Eucommiaulmoides;MVA pathway;MEP pathway;expression analysis;subcellular localization

国家十二五科技支撑计划(2012BAD21B0502)；国家公益性行业科研专项(201004029)

王淋(1986—)，女，博士研究生，主要从事经济林育种的研究。

* 通信作者：E-mail：tanatanan@163.com

2016-06-28

* Corresponding author：E-mail：tanatanan@163.com

Q949.751.5

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.01.008