基于RNA-seq对南蛇藤MADS-box转录因子序列及表达分析

祖奎玲 董树斌 李建霞 赵芸玉 赵良成

(北京林业大学自然保护区学院，北京 100083)

基于RNA-seq对南蛇藤MADS-box转录因子序列及表达分析

祖奎玲 董树斌 李建霞 赵芸玉 赵良成*

(北京林业大学自然保护区学院，北京 100083)

为了分析南蛇藤MADS-box转录因子对其雌花发育和果实形成的调控信息，本文基于南蛇藤的转录组数据，获得15个具有全长开放阅读框的MADS-box转录因子(ColMADS)，并利用生物信息学方法对其性质和结构特性进行了分析。结果表明，基因comp37814_g1和comp41380_g2属于M-type家族，不含有K盒结构，其他均为MIKC家族；除了comp37713_g1之外，其余均属于不稳定的亲水性蛋白；二级结构均含有α-螺旋、扩展链结构、β-转角和无规则卷曲，其中α-螺旋所占比例最高；序列主要包含5种保守基序，基序1和基序2分别含50个氨基酸且属于该基因家族的保守基序，仅基序1含有MADS盒。系统进化分析结果显示南蛇藤ColMADS转录因子被分为10个进化支，分属于不同类型的亚家族及不同的组。另外，利用荧光定量PCR检测方法揭示了这些基因在南蛇藤盛花、落花和幼果不同发育时期的表达情况。结果表明，2个基因在盛花期相对表达值最高，9个基因在落花期相对表达值最高，在幼果形成过程中有4个基因显著上调表达。

南蛇藤；MADS-box基因；雌花；序列及表达分析

南蛇藤(CelastrusorbiculatusThunb.)是卫矛科(Celastraceae)南蛇藤属(Celastrus)落叶木质藤本植物，不仅具有重要的药用价值，其茎、蔓、叶、花及果实还具有很好的观赏价值，尤其是成熟的果实，果皮开裂呈现出鲜艳的红色假种皮结构，在造园上应用价值极高。近年来，国内外对南蛇藤的研究主要集中于系统分类[1]、药用价值[2]、化学成分[3]、繁殖生态学[4]等方面，而对花和果实发育分子机理的研究仍是空白。

MADS-box转录因子是一类能与真核基因启动子区域的顺式作用特异性结合，促使目的基因在特定时空表达的蛋白质分子，其名称来源于酿酒酵母MCM1、拟南芥AGAMOUS、金鱼草DEFICIENS和人类的SRF4基因的首字母，这4个基因编码的蛋白均有1个由56～58个氨基酸组成的高度保守区的MADS盒[5]。它广泛存在于动物、植物和真菌中，调控其生长发育和信号转导等重要生命过程[6]。在植物中，MADS-box主要参与被子植物花发育的各个阶段的调节过程，在花形态建成和开花时间调节中发挥最重要的功能[7]。根据进化特征，MADS-box基因分化为TypeⅠ和TypeⅡ两类。TypeⅡ基因由MADS(M)、Intervening(I)、Keratin-like(K)和Carboxyl-terminal(C)4个结构域构成，亦称MIKC基因，且K结构域仅存在于TypeⅡ中[8]。目前，在植物花发育的ABCDE模型中，与植物成花相关的功能基因多数是TypeⅡ型，主要有AP1、AP3、AG、FLC、SVP和SOC1等，而TypeⅠ基因的功能报道较少[9]。

近年来，随着高通量测序技术的不断发展，大量植物种类的MADS家族基因已被发现，不同物种MADS-box基因家族成员的数量和表达特性存在较大差异。南蛇藤具有雌雄异株和雄全同株的多性型花发育特征，其中雌花花期最长且数量明显多于两性花，可决定果实发育的数量[10]，但其发育的调控机理目前尚不清楚。本研究通过分析南蛇藤雌花和果实的转录组数据，发现了39个unigene序列被注释为MADS-box转录因子，其中15个序列具有完整的ORF，但其生物信息学特征和表达特性仍不清楚。因此，本文对15个具有完整ORF的MADS-box转录因子进行了生物信息学特性分析，鉴定MADS-box家族基因并对其在南蛇藤不同组织中的表达情况作了定量分析，旨在为探明南蛇藤雌花发育和果实形成的分子机理提供一定的参考依据，为下一步MADS-box转录因子的克隆和功能验证奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料来源于北京中国科学院植物研究所的南蛇藤雌性植株。根据前期对南蛇藤从花蕾到果实发育过程的形态解剖特征观察，分别采集同一生长点的南蛇藤盛花、胚珠发育后凋零的花及幼果，经液氮迅速冷冻后放入-80℃冰箱低温保存用于总RNA提取。

1.2 方法

1.2.1 南蛇藤MADS-box转录因子序列来源

基于前期对南蛇藤雌花和果实的高通量Illumina测序获取的转录组数据(拼接结果尚未发表)，对获取的unigene进行比对和功能注释，使用NCBI在线分析程序ORF Finder(Open Reading Frame Finder,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)查找开放阅读框,并使用iTAK软件和在线预测工具The GENSCAN Web Server(http://argonaute.mit.edu/GENSCAN.html)对获取的unigene进行分析，39个Unigene序列被注释为MADS-box转录因子,但只有15个序列含有完整的ORF,均含有MADS超家族保守结构域，命名为ColMADS，以此作为后期分析的主要对象。

1.2.2 南蛇藤MADS-box转录因子序列特征

在植物转录因子数据库PlantTFDB(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)中进行氨基酸序列预测，并使用在线软件ProtParam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)进行氨基酸数目、相对分子质量、理论等电点、分子式、脂肪族氨基酸数、蛋白质疏水性、不稳定系数等的分析。亚细胞定位使用PSORT(http://psort.hgc.jp/form.html)在线软件，依据蛋白数据库对本研究中蛋白质进行亚细胞定位。二级结构特性利用ExPaSy提供的在线程序SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl/page=npsa_sopma.html)预测分析α螺旋、β折叠、延伸链和无规则卷曲。保守序列分析利用在线数据库MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)，参数设置为:同一基序在1条序列中出现0或1次,基序最大发现值为5,长度范围为60个氨基酸残基,其他参数为默认值。基序序列特征分析采用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在线软件分析。

1.2.3 南蛇藤MADS-box基因家族系统进化分析

在TAIR(http://www.arabidopsis.org/)数据库上下载拟南芥的MADS-box蛋白序列，利用Clustal2.0软件对所有蛋白和15条南蛇藤转录因子进行多序列比对和系统进化分析，再利用MEGA6.0绘制分子进化树，采用neighbor-joining法则的Poisson Correction模型Bootstrap method值取1 000。

1.2.4 RNA提取及Real-time RT-PCR分析

采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(天根)进行总RNA提取,利用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo Scientific，USA)和Agilent 2100 Bioanalyzer测定浓度及OD260/OD280，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。

利用PrimerScript RT reagent Kit(TaKaRa，Japan)将待测RNA逆转录成cDNA。逆转录反应体系：总RNA，0.5 μg；50 μmol·L-1oligo dT，0.5 μL；100 μmol·L-1random 6 mers，0.5 μL；5×PrimerScript Buffer，2 μL；Primer Script RT Enzyme Mix I，0.5 μL；Nuclease-free H2O，加至10 μL。反应程序：37℃ 15 min，85℃ 5 s。逆转录完毕后加入90 μL Nuclease-free H2O储存在-20℃冰箱备用。引物采用Roche LCPDS2软件设计并由上海捷瑞生物工程有限公司合成，内参基因选用18 S，序列见表1。

表1 Real-time RT-PCR引物序列

Real-time RT-PCR反应体系：2×LightCycler® 480 SYBR Green I Master，5 μL；10 μmol·L-1Forward primer，0.2 μL；10 μmol·L-1Reverse primer，0.2 μL；cDNA，1 μL；Nuclease-free H2O，3.6 μL。PCR程序：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环，设置3次重复。循环结束后利用熔解曲线检测产物特异性：从60℃缓慢升温至97℃，每1℃采集5次荧光信号。反应在LightCycler® 480 Ⅱ型荧光定量PCR仪(Roche，Swiss)上完成。试验数据采用2-ΔΔCt算法进行分析计算[11]。

2 结果与分析

2.1南蛇藤MADS-box转录因子的生物信息学分析

通过对南蛇藤雌花和果实高通量Illumina测序获取的转录组数据进行分析，发现39个Unigene序列被注释为MADS-box转录因子，其中15个序列含有完整的ORF。将15个MADS-box氨基酸序列在PlantTFDB数据库中进行预测,结果表明，comp37814_g1和comp41380_g2属于M-type家族,不含有K盒结构,其他均为MIKC家族,同时获得同源性最高的拟南芥氨基酸序列，其中9个转录因子属于K-box和MADS-box特征家族蛋白(表2)。

对氨基酸数目、相对分子质量的分析表明，南蛇藤MADS-box的氨基酸序列数量均在200～275，对应的分子量在22 911.4～31 531.9。等电点分析表明，comp37814_g1、comp33345_g1、comp43219_g1、comp40128_g2、comp6895_g1呈酸性，其他的呈碱性(comp39346_g1接近中性)。从不稳定指数来看，comp37713_g1指数小于40，为稳定蛋白，其他为不稳定蛋白。15个MADS-box的氨基酸的脂溶指数均小于100，为亲水性蛋白(表3)。南蛇藤MADS-box蛋白质二级结构均含有α-螺旋、扩展链结构、β-转角和无规则卷曲。其中，α-螺旋所占比例最高，其次是无规则卷曲。亚细胞定位分析表明，comp24959_g2和comp34522_g1定位到细胞质上的概率较高，comp43365_g3定位到质膜上的概率较高，其他蛋白质都定位到细胞核上(表4)。

2.2 南蛇藤MADS-box氨基酸序列保守基序分析

对南蛇藤MADS-box氨基酸序列的保守基序分析结果表明：基序1和基序2含50个氨基酸,在所有MADS-box序列中均含有。对应最佳匹配序列分别是MGRGKIEIKRIENTTNRQVTFCKRRNGL-LKKAYELSVLCDAEVALIVFST和EVNKLKAKYE-NLQRTQRHLLGEDLGPLSVKELQNLEKQLEAALVL-TRQRK(图1)。除comp41380_g2外，基序3在所有MADS-box序列中均含有，基序3的最佳匹配序列是RGKLYEFCSSSS。基序4含有31个氨基酸，仅次于基序1和基序2，其最佳匹配序列为TQYMLDQFSDLQNKEHMLMESNKALTMKLEE，但在comp39346_g1、comp37713_g1、comp33345_g1、comp37814_g1和comp41380_g2序列中不包含基序4。基序5含有的氨基酸数量最少，其最佳匹配序列为CLERYQKCSYS(图2)，在comp37713_g1、comp33345_g1、comp37814_g1和comp41380_g2序列中不包含基序5。利用SMART在线工具对5个基序命名，只有基序1(number:SM00432)为MADS盒，属于SRP-TF结构域，其他序列命名未知。

表2 南蛇藤MADS-box转录因子在PlantTFDB数据库预测信息

表3MADS-box基因家族氨基酸成员的基本信息

Table3ThebasicinformationofC.orbiculatusMADS-boxgenefamily

Unigene编号UnigeneID氨基酸数量Numberofaminoacids(aa)分子量Molecularweight(Da)等电点TheoreticalpI不稳定指数Instabilityindex脂溶指数Aliphaticindexcomp37814_g124627879.85.4649.0988.82comp33345_g120022911.45.0157.9664.09comp40042_g123026345.98.7945.383.13comp43219_g124627888.56.4854.8286.75comp41380_g227531531.99.6860.8964.22comp40805_g124728327.19.4458.8775.47comp24959_g224528441.48.9153.8687.18comp34522_g124628313.18.4943.1375.33comp18144_g124828215.29.1741.8381.37comp40128_g223025938.36.1854.7883.09comp37381_g122325800.49.5345.683.99comp43365_g3217251589.259.4482.26comp37713_g123026680.29.3133.1675.43comp6895_g1240281316.7655.4382.08comp39346_g120924426.87.0268.8280.67

表4南蛇藤MADS-box蛋白家族二级结构及亚细胞定位

Table4ThesecondarystructureandsubcellularlocationofC.orbiculatusMADS-boxgenefamily

名称NameNR编号NRIDα-螺旋(个)Alphahelix扩展链结构(个)Extendedstrandβ-转角(个)Betaturn无规则卷曲(个)Randomcoil亚细胞定位Subcellularlocalizationcomp37814_g1XP_007043361.1109491672细胞核Cellnuclearcomp33345_g1KCW61921.189241473细胞核Cellnuclearcomp40042_g1KDP43607.1128311160细胞核Cellnuclearcomp43219_g1XP_007043947.1121461564细胞核Cellnuclearcomp41380_g2XP_006382260.11163416109细胞核Cellnuclearcomp40805_g1XP_007025250.1124381075细胞核Cellnuclearcomp24959_g2XP_007037634.1128392652细胞质Cytoplasmcomp34522_g1ACD39982.1139272159细胞质Cytoplasmcomp18144_g1XP_007051983.1119362271细胞核Cellnuclearcomp40128_g2CDP01559.1119342453细胞核Cellnuclearcomp37381_g1XP_007020163.1134292436细胞核Cellnuclearcomp43365_g3XP_007051978.1138251143质膜Membranecomp37713_g1NP_001267937.1101522948细胞核Cellnuclearcomp6895_g1XP_007043265.1118351572细胞核Cellnuclearcomp39346_g1ADX86812.194423043细胞核Cellnuclear

图1 南蛇藤MADS-box保守基序Fig.1 Conserved motifs identified from MADS-box genes in C.orbiculatus

图2 南蛇藤MADS-box基因保守元件分布图Fig.2 Distribution of the identified motifs in MADS-box genes in C.orbiculatus

2.3 MADS-box家族基因保守结构域系统进化分析

为揭示MADS-box基因家族间的进化关系，采用邻接法对15个南蛇藤和拟南芥MADS-box保守结构域进行系统进化分析。结果如图3所示，南蛇藤15个MADS-box被分为10个进化支(两个为未知亚组)，分属于不同类型的亚家族及不同的组。其中，comp40042_g1、comp34522_g1和comp18144_g1属于SEP亚组，comp33345_g1属于FLC亚组，comp43365_g3属于SOC1亚组，comp43219_g1属于AGL亚组，comp37713_g1、comp39346_g1、comp40805_g1和comp37381_g1属于AG亚组，comp37814_g1和comp6895_g1分别属于TT16和MADS57两个亚组，这两个家族包含的拟南芥氨基酸数目较少，comp41380_g2属于AGL80亚组，较其他氨基酸相对独立。

从基因的进化树分析表明，FBP2和SEP2进化关系最近，且与AGL6有较近的进化关系，均属于SEP家族，为控制花形态建成的同源异型基因；AGL8与前三个基因在同一个大的进化支上；FLC与SOC1分属于两个相邻的进化分支；AGL15与JOINTLESS进化关系接近；AG1、AGL11、PMADS和PMADS2这4个基因的进化关系接近，MADS57和AGL80分别独立分支且AGL80与南蛇藤其他MADS-box基因进化关系较远(图3)。

图3 南蛇藤和拟南芥的MADS-box转录因子保守结构域系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of MADS-box conserved domain from C.orbiculatus and Arabidopsis

2.4 南蛇藤MADS-box基因组织表达分析

通过Real-time RT-PCR分析MADS-box基因在南蛇藤不同组织中的表达情况，结果如图4所示，这15个MADS-box基因在南蛇藤雌花发育和果实形成过程中均有不同程度的表达。其中，MADS57、FLC、FBP2、AGL8、AG1、AGL15、SEP2、SOC1和JOINLESS在落花期相对表达量最高，而在幼果期SEP2、SOC1和JOINLESS相对表达量最低，推测这些基因可能参与南蛇藤花器官的凋亡和幼胚的形成；PMADS和PMADS2在盛花期相对表达量最高，随着果实发育，其表达水平呈现明显下降趋势，在幼果期表达量极低，说明这2个基因主要参与南蛇藤雌花的发育过程；而AGL6、AGL80、AGL11和TESTA16的相对表达值在幼果期却明显上升至最高峰，表明这4个基因对南蛇藤果实发育起促进作用。

图4 南蛇藤MADS-box基因在不同发育阶段的表达分析 CO1.盛开的雌花；CO2.落花；CO3.幼果Fig.4 The expression analysis of MADS-box genes of C.orbiculatus in different development periods CO1. Full blooming； CO2. Flower senescence；CO3. Young fruit

3 讨论

南蛇藤生长适应性强，在园林绿化、药用等方面均具有重要的价值[12]。然而，其雌雄异株且少量雄全同株的性别多样性特征导致结实率不稳定，制约了该植物资源的开发和利用。目前南蛇藤基因组背景信息非常缺乏，本文首次通过分析其雌花和果实的转录组数据获得了15个具有完整ORF的MADS-box转录因子，并对其氨基酸基本信息、亚细胞定位、氨基酸结构、保守结构域特征、系统进化关系及其在花和果实中的表达情况做了定量分析，不仅丰富了植物MADS-box基因家族信息，也为南蛇藤雌花发育和果实形成的调控机理研究提供了一定的理论基础，对该植物资源的开发和利用具有促进作用。

MADS-box基因家族广泛存在于高等植物中，对花器官分化、开花时间的调节及果实发育与成熟等方面起关键调控作用[13]。目前许多植物的MADS-box家族基因在不同层面上已被研究，结果表明不同物种MADS-box基因家族成员的数量和表达特性存在较大差异。在MADS-box家族基因的两种结构类型中，大量的研究集中于MIKC型基因。植物MIKC型基因可以分为13个亚家族，而拟南芥基因组中含有12个亚家族[14～15]。本研究基于南蛇藤的转录组数据鉴定出13个MIKC型基因和2个M-type型基因，它们分属于10个不同的进化支，这些基因可能通过相互作用来调控南蛇藤雌花的发育和果实的形成。

被子植物的花器官发育取决于不同发育阶段调控基因特定的时空表达和相互作用[16]。本研究发现一些参与花形态建成ABCDE模型中的关键基因(如AGL8、AG1、AGL15、SEP2)与调控开花时间的基因(如FLC和SOC1)在南蛇藤落花期相对表达量最高，说明这些基因可能协同作用于南蛇藤花器官凋亡及幼胚形成过程。AGL8基因，又称为FRUITFULL(FUL)，属于ABCDE模型中的A类基因，在花发育整个时期的不同组织中均有表达[17]。在南蛇藤盛花和落花阶段，AGL8基因均有显著表达，说明该基因在南蛇藤雌花发育中起着主要正向调控作用。在植物开花时间的调控研究中，FLC基因是首次在拟南芥中发现的控制开花时间基因[18]，后来研究发现，低温能够促进FLC基因的表达，而FLC通过抑制SOC1的表达来抑制成花[19]。FLC和SOC1在调控开花时间过程中，两者相互作用并且能被外在环境和自身内源信号所诱导。本研究发现，FLC和SOC1在南蛇藤MADS-box基因家族中占有重要位置，在进化树是源自同一分支，并且在南蛇藤雌花发育整个过程中显著表达，两者均是在花器官脱落、幼胚发育时期具有最高的相对表达量。由此可见，花器官形态建成和开花时间的调节是相互关联的调控的过程，这些基因参与花发育的各个阶段的调节并且相互作用。南蛇藤开花时间相关基因的调控过程有待下一步通过同源克隆等方法探究其功能。

在果实发育阶段，AG类基因和E类基因发挥重要调控作用[20]。模式植物拟南芥中，已经成功分离出FBP7、FBP11、STK、SHP和SEP等与胚珠发育密切相关的基因，现已发现SHP1和SHP2在心皮壁与胚座框之间的边界区表达，调控边界区分裂层的分化以及木质化层的木质化[21]。在番茄果实发育的研究中发现，与拟南芥SHP同源的AGAMOUS-LIKE1(TAGL1)基因在果实发育早期及成熟期均显著表达[22]。但在本研究中并未发现SHP及其同源基因对南蛇藤果实发育的特异性表达调控。SEP类基因在植物发育中研究较深入并且其功能多样，在水稻中，SEP类基因调控花器官的发育和小穗形态特征等[23]；在草莓中，SEP类基因对花器官发育及果实成熟起重要的调控作用[24]。本研究中，SEP2基因在落花期显著表达，并随着果实的发育其表达量呈下降趋势，推测该基因对胚珠的发育起显著促进作用，但对果实成熟的调节下调表达。AGL6为SEP类的姐妹类群，但其在功能上不同于SEP类基因。例如，在拟南芥中，AGL6基因在苞叶、四轮花器官和胚珠的原基中仅在近轴一侧表达，并通过限制开花抑制因子FLC和MAF的表达来促进开花的提前[26]。本研究中，AGL6基因的相对表达值在盛花期和落花期较低，而幼果期最高，推测AGL6不仅与南蛇藤果实发育有关，也通过与雌花发育相关基因的相互作用促进开花及花器官的形成，但需要进一步深入对其功能进行研究。

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This work was supported by funding from the National Natural Science Foundation of China(31370213)；Beijing Natural Science Foundation(5133036)

introduction：ZU Kui-Ling(1991—),female,Master,mainly engaged in molecular biology of plant development.

date:2016-07-06

SequenceandExpressionAnalysisofMADS-boxGenesinCelastrusorbiculatusThunb.BasedonRNA-seqData

ZU Kui-Ling DONG Shu-Bin LI Jian-Xia ZHAO Yun-Yu ZHAO Liang-Cheng*

(School of Nature Reservation,Beijing Forestry University,Beijing 100083)

For the regulatory information of MADS-box genes on the flower and fruit development inCelastrusorbiculatusThunb, 15 MADS-box genes(ColMADS) with full ORF(Open Reading Frame)were identified from transcriptome generated from female flower and fruit. The features of the proteins were analyzed by the bioinformatics methods. The comp37814_g1and comp41380_g2 belonged to M-type family, while other 13 genes were the members of MIKC. All were unstable hydrophilic proteins except for comp37814_g1. Alpha helix, beta turn, extended strand and random coil were found from the secondary structure ofColMADSprotein, and alpha helix was major part. Five motifs were identified. The Motif 1 and Motif 2, both consisting of 50 amino acids, were the conserved structure of MADS-box family and only Motif 1 contained MADS domain. By phylogenetic analysis, 15ColMADSgenes were divided into 10 clades, belonging to different subfamilies and groups. In addition, the expression patterns of the genes among different development stages were analyzed using real-time RT-PCR. Two genes were highly expressed at flower blooming stage and nine genes were obviously expressed at flower senescence stage. There are four genes upregulated during the young fruit development.

CelastrusorbiculatusThunb.;MADS-box genes;female flower;sequence and expression analysis

国家自然科学基金(31370213)；北京市自然科学基金(5133036)

祖奎玲(1991—)，女，硕士研究生，主要研究方向是植物发育分子生物学。

* 通信作者：E-mail:lczhao@bjfu.edu.cn

2016-07-06

* Corresponding author：E-mail:lczhao@bjfu.edu.cn

Q949.754.7

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.01.010