西藏地区雪层杜鹃遗传多样性的AFLP分析

徐静静 赵 冰* 张良英 申惠翡 李厚华

(1.西北农林科技大学风景园林艺术学院，杨陵 712100； 2.西藏大学农牧学院，林芝 860114)

西藏地区雪层杜鹃遗传多样性的AFLP分析

徐静静1赵 冰1*张良英2申惠翡1李厚华1

(1.西北农林科技大学风景园林艺术学院，杨陵 712100；2.西藏大学农牧学院，林芝 860114)

采用AFLP技术对西藏地区雪层杜鹃(Rhododendronnivale)5个天然种群135份材料进行遗传多样性和遗传分化研究。筛选得出的6对引物共扩增产物273条DNA片段，扩增多态位点百分率为85.71%。5个雪层杜鹃种群的遗传多样性指标表现了相似的变化趋势，Nei基因多样性指数(h)和Shannon信息指数(I)的变化趋势一致，均为工布江达县种群<米林种群<嘎隆拉种群<色季拉山种群<红拉山种群。POPGENE分析结果表明雪层杜鹃在物种水平(PPL=85.71%，I=0.415 1，h=0.273)具有较高的遗传多样性，种群水平(PPL=62.26%，I=0.280 3，h=0.184 1)的遗传多样性较低。AMOVA分析结果表明36%的遗传变异存在于种群间，64%的遗传变异存在于种群内，雪层杜鹃种群间的遗传分化系数(Gst=0.324)与AMOVA分析得到的遗传变异分布结果一致。UPGMA聚类结果说明雪层杜鹃的遗传距离与地理距离和海拔高度没有明显的相关性。综合分析，引起雪层杜鹃的遗传变异的原因可能是地理环境不同和种群的生境类型差异。最后就雪层杜鹃的合理开发和保护提出建议。

西藏；雪层杜鹃；遗传多样性；AFLP；种群

西藏及其周边地区是世界上高山植物最丰富的地区，为野生杜鹃花资源提供了最好的生态环境，与云南和四川共同形成了杜鹃花世界分布中心[1～2]。雪层杜鹃(Rhododendronnivale)是杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花属(Rhododendron)的常绿小灌木，枝叶具有特殊的芳香气味，主要分布于海拔3 200～5 490 m的灌丛中，是西藏分布较广泛的杜鹃花类型之一，也是分布到林区最外缘的主要杜鹃花种群之一[3]。目前，有关西藏地区雪层杜鹃的研究较少，相关研究主要集中于植物群落研究[4]和化学成分研究[3]，然而对雪层杜鹃遗传多样性研究未见报道。雪层杜鹃不仅具有分布范围广、海拔高的优点，而且具有较高的观赏价值，可用于林缘配植，对雪层杜鹃的遗传多样性的研究对该种质的开发利用和资源保护具有重要意义。

遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，是物种多样性的基础[5]。物种的遗传多样性水平可以直观反映该物种的繁殖力和环境适应力，研究植物遗传多样性对植物种质资源的保护和开发利用具有重要的指导作用[6～7]，不同物种的遗传多样性水平和遗传结构差异很大。因此，制定一个物种的保护和开发策略需要以该物种的遗传多样性研究为理论前提[7]。此外，研究物种的遗传多样性和遗传结构可以确定该物种的观赏特征与基因型关系，为快速培育新品种奠定基础[8]。有研究表明植物遗传多样性水平受多种因素综合影响，如生命形式、分类地位以及地理环境等[5,9]。目前研究地理因素对杜鹃花种群遗传多样性的影响成为杜鹃花遗传多样性研究的热点之一。国内对杜鹃花遗传多样性和遗传分化的研究起步较晚，近年来关于杜鹃花种群遗传多样性的研究主要集中于秦岭地区杜鹃花种群的遗传多样性[7,10～11]、井冈山地区[12]、长白山[9,12]等，西藏地区杜鹃花遗传多样性研究尚未见报道。

目前AFLP标记技术已经被用于研究杜鹃花属种群遗传多样性、遗传结构和种间遗传分化中，并且证明了不同种质资源可能具有不同的遗传关系[7]。为此本研究利用AFLP分子标记技术分析了西藏地区雪层杜鹃种群的遗传多样性和遗传结构，并且结合种群生境条件和资源特点提出了雪层杜鹃的开发和保护建议，旨在从分子水平上研究雪层杜鹃种内不同地域种群间的遗传多样性和遗传分化，为雪层杜鹃种质资源的科学保护提供理论依据，并为合理开发利用该杜鹃花资源、培育适应高原环境的杜鹃花新品种提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

雪层杜鹃在西藏地区广泛分布，选择有代表性的5个种群。根据种群规模随机选取25～35株个体采样，采样个体间相距5米防止采集无性繁殖植株，采集样本地理生态因子状况如表1。选取当年生新鲜幼嫩叶片，硅胶干燥储存于-80℃冰箱中。

表1 供试材料资源特点及来源

1.2 基因组DNA的提取

使用北京天根生化科技有限公司提供的植物基因组DNA试剂盒提取样本总DNA，利用紫外分光光度计(Bio-RAD SmartspecMT3000)检测DNA浓度，1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。将DNA稀释至50 ng·μL-1后保存于-20℃冰箱中备用。

1.3 AFLP试验

试验参照Vos等[13]的方法进行。试验所需引物和MseⅠ和EcoRⅠ接头由北京奥科生物科技有限公司合成，限制性内切酶MseⅠ、EcoRⅠ和T4DNA连接酶由Thermo Fisher公司提供，所有反应都在Eppendorf PCR仪上进行。

1.3.1 酶切与连接

本试验采用酶切和连接共同反应的方法，使用25 μL反应体系：2.5 μL基因组DNA(50 ng·μL-1)，2.5 μL 10×Tango buffer，0.5 μLEcoRⅠ(10 U·μL-1，Thermo，China)，0.5 μLMseⅠ(10 U·μL-1，Thermo，China)，0.2 μL T4DNA ligase(10 U·μL-1，Thermo，China)，0.5 μLEcoRⅠ接头(5 pmol·μL-1)，0.5 μLMseⅠ接头(50 pmol·μL-1)，0.5 μL ATP(10 mmol·μL-1)和17.3 μL ddH2O，使混合物在37℃条件下反应3 h。产物用1.8%琼脂糖凝胶电泳检测，并将产物稀释10倍备用。

1.3.2 PCR扩增

预扩增使用20 μL反应体系：5 μL酶切连接后模板DNA，4.4 μL ddH2O，10 μL Taq premix(TaKaRaTaqTMVersion 2.0，TaKaRa Biotech.，Dalian Co.，Ltd.，China)和分别0.3 μL E-0、M-0引物(50 ng·μL-1)。反应程序：首先94℃预变性2 min；然后进行22个循环的下列反应，94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min；最后72℃延伸10 min。预扩增产物用1.8%琼脂糖凝胶电泳检测，并将产物稀释10倍备用。

选择扩增反应使用20 μL反应体系：5 μL预扩增后模板DNA，4 μL ddH2O，10 μL Taq premix(TaKaRaTaqTMVersion 2.0,TaKaRa Biotech.,Dalian Co.,Ltd.,China)和分别0.5 μL E-、M-引物(50 ng·μL-1)。反应程序：首先94℃预变性4 min；其次进行12个循环的下列反应94℃预变性30 s，65～56℃退火30 s(退火温度每循环降低0.7℃)，72℃延伸1 min；然后进行24个循环的下述反应94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min；最后72℃延伸8 min。

1.3.3 PCR产物检测

本试验采用聚丙烯酰氨凝胶电泳法检测选择扩增产物，银染法观察电泳图谱。按1:2的比例混合加样缓冲液和选择扩增产物，在PCR仪中95℃变性8 min后迅速放置在冰上防止复性，变性产物用于电泳检测。电泳装置为DXY-12型电脑三恒多用电泳仪和64孔北京六一电泳槽。取4.5 μL变性产物，在1 200 V恒定电压下电泳90 min，银染后在X线胶片观察等下观察。

1.4 数据处理

将电泳谱带信息转化成(0,1)二元矩阵，观察电泳图谱同一位点上有无DNA条带，有条带记为1，无则记为0。在假定Hardy-Weinberg平衡状态下，使用POPGENE1.32[14]分析种群遗传多样性参数：多态性位点百分比(PPL)，有效等位基因数(Ne)，Nei’s基因多样性指数(h)，Shannon信息指数(I)，遗传分化系数(Gm)和基因流(Nm)。利用NTSYSpc 2.10[15]软件根据种间遗传距离进行非加权算数平均聚类分析(UPGMA)，构建种间聚类树形图。采用GenAlEx 6.5[16]软件对种群的遗传分化进行AMOVA(analysis of molecular variance)方差分析。

2 结果与分析

2.1 引物筛选及扩增片段多态性分析

本试验采用64对引物作为初选引物对，每个种群选择5个样本用于筛选引物，从中共筛选出14对能扩增出条带明亮、分辨能力强、带型分布均匀且多态性高且引物，引物序号分别为M6E4、M6E2、M4E5、M4E7、M6E7、M7E2、M5E1、M5E4、M5E5、M5E7、M5E8、M5E6、M4E1、M8E6。最终从14对引物中选取6对扩增条带较多的引物对分别对5个种群的135个个体进行扩增，共扩增出273条DNA片段，其中234条是多态性片段，占扩增片段总数的85.71%(表2，图1)。

表2引物对及其选择性扩增产生条带多态性

Table2Polymorphismofselectiveamplificationbasedonsixprimerpairs

引物序号Primercode碱基序列Sequence(5'-3')扩增位点Amplificationlocus多态性位点Polymorphismlocus多态性位点百分比PPL(%)M4E5MCAT-/E-ACC463882.61M4E7M-CAT/E-AGC342985.29M5E1M-CTA/E-AAC514486.27M5E5M-CTA/E-ACC534686.79M5E7M-CTA/E-AGC474085.11M8E6M-CTT/E-AGG423788.10平均Average45.53985.71

图1 引物对M-CTA/E-AGC对雪层杜鹃米林种群的扩增谱带Fig.1 AFLP fingerprinting patterns of R.nivale samples in Milin, generated by M-CTA/E-AGC

2.2 种群及物种水平的遗传多样性分析

多态性位点百分比(PPL)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s基因多样性指数(h)和Shannon信息指数(I)是评价遗传多样性水平的常用指标(表3)。

表3西藏地区雪层杜鹃5个种群的遗传多样性参数

Table3Geneticdiversityindexof5populationsofR.nivale

种群Population多态条带数PolymorphismbandsPPL(%)NehI嘎隆拉Galongla(GL)17865.21.28960.17930.2798米林县Milin(M)16359.71.24160.14170.2123色季拉山SejilaMountain(SD)16861.541.33700.19950.3011工布江达县Gongbujiangda(G)15958.241.23160.13590.2064红拉山HonglaMountain(YH)19772.161.43960.26390.4018平均Mean17363.361.30790.18410.2803物种水平Specieslevel23485.710.1840.2730.4151

通过分析西藏地区雪层杜鹃的5个种群遗传多样性得出不同种群间的多态位点百分比不同，工布江达县种群的多态位点百分比最低，红拉山的多态位点百分率最高。种群水平上PPL由低到高的顺序依次为G

2.3 种群遗传分化分析

根据POPGENE分析得出种群间的遗传分化系数(Gst)为0.324，表明雪层杜鹃5个种群间存在一定程度的遗传分化，种群间遗传变异指数为32.4%，种群内的遗传变异为67.6。因此可以推断出遗传变异主要存在于种群内，这与AMOVA分析结果相一致(表4)。AMOVA分析中，64%的变异来源于种群内，36%的变异来源于种群间。POPGENE分析显示种群基因多样性Ht为0.272 3；种群内基因多样性Hs为0.184；5个种群的基因流(Nm)为1.043 2，表明在种群间缺乏有效的基因交流，种群间具有一定的遗传分化，遗传变异主要存在于种群内。

表4西藏地区雪层杜鹃种间和种内分子变异的方差分析

Table4AnalysisofAMOVAwithinandamongR.nivalepopulations

变异来源Sourceofvariation自由度df平方和SS均方MS变异组分Variancecomponent变异率Percentageofvariance(%)P种群间Amongpopulations4886.716221.6797.73636%<0.01种群内Withinpopulations1301777.52113.67313.67364%

2.4 种间遗传关系分析

利用POPGENE计算得到的5个种群的遗传一致度和遗传距离进行UPGMA分析，以进一步分析雪层杜鹃的遗传分化程度。根据各种群间的遗传相似性系数，采用NTSYS软件对5个雪层杜鹃种群进行UPGMA聚类分析。由表5可得出5个种群的遗传一致度在0.752 3～0.951 3，最大的遗传一致度产生在米林和工布江达县种群间，最小的产生在米林和色季拉山种群间。种群间的遗传距离在0.05～0.284 6，其中米林县和工布江达县种群的遗传距离最小，米林县和色季拉山种群间的遗传距离最大。

表5雪层杜鹃种群间Nei’s遗传一致度(右上)和遗传距离(左下)

Table5Nei’sgeneticidentityandgeneticdistanceof5populationsofR.nivale

种群Population嘎隆拉Galongla(GL)色季拉山SejilaMountain(SD)米林Milin(M)工布江达Gongbujiangda(G)红拉山HonglaMountain(YH)嘎隆拉Galongla(GL)10.86630.83490.81320.9310色季拉山SejilaMountain(SD)0.143510.75230.76110.8691米林Milin(M)0.18040.284610.95130.9441工布江达Gongbujiangda(G)0.20680.2730.0510.9431红拉山HonglaMountain(YH)0.07150.14030.05760.05861

由图2可看出5个不同的种群间有一定的遗传距离，也可以聚类到一起，表明5个种群具有相同的遗传背景，并且存在着遗传差异。其中米林县和工布江达县种群遗传一致度最大，且与红拉山种群聚类到同一组，表明这3个种群具有较近的遗传距离。嘎隆拉和色季拉山种群聚类到另一个组，说明这两个种群间有较近的遗传距离，与其他3个种的遗传距离较远，遗传距离与地理距离之间相关性不显著。经Mantel检验得出5个种群的遗传距离与地理距离之间不存在显著的相关性(R=0.603 1,P=0.894 0,P=0.114 0)。西藏地区的地形和气候环境复杂多样以及雪层杜鹃的生活习性，可能是导致5个种群间有着较显著的遗传分化的原因。

图2 雪层杜鹃种群UPGMA聚类图Fig.2 UPGMA dendrogram for 5 populations of R.nivale

3 讨论与结论

3.1 雪层杜鹃的遗传多样性和遗传分化

近年来分子标记方法被广泛地用于分析植物亲缘关系和遗传多样性，例如RAPD[17]、ISSR[18]、SSR[12]、AFLP[10]等。AFLP是一种高效的分子标记方法，适合用于标记总基因组检测遗传多样性，并且AFLP可以标记大量的基因位点具有很高的多态性和可重复性[13]。曾有研究表明，在基因序列未知的情况下，分析亲缘关系较近的植物遗传多样性，AFLP标记技术是比较好的选择[19]。本试验共筛选出6对引物用于135份样本的选择性扩增，各引物对扩增结果的多态性位点百分率在是82.61%～88.10%，平均值为85.71%。结果与秦岭秀雅杜鹃(Rhododendronconcinnum)遗传多样性的分析结果相似，远远大于红花(Carthamustinctorius)遗传多样性的分析结果[20]。POPGENE计算得出物种水平上多态位点百分比为85.71%，大于大树杜鹃(Rhododendronprotistumvar.giganteum)遗传多样性的分析结果[21]。这些结果表明AFLP分子标记技术可以用于分析雪层杜鹃的遗传多样。

试验取样地主要位于西藏东部，分布于念青唐古拉山脉、喜马拉雅山脉以及横断山脉中，地形复杂、气候环境多样，是植物种类和生境类型极其丰富的地区。杜鹃花属植物资源是西藏地区重要的群落基础，是西藏地区高山灌丛植被类型的重要组成部分[4]。雪层杜鹃生长海拔较高、分布广、观赏价值高，是极具开发价值的植物之一。本试验利用AFLP标记方法分析西藏地区雪层杜鹃野生资源的遗传多样性，为该物种的科学开发提供理论参考。

西藏地区5个雪层杜鹃种群遗传多样性指标分析结果表明，物种水平上多态性位点百分比(PPL=85.71%)和Shannon信息指数(I=0.415 1)，略小于秦岭地区5个美容杜鹃的研究结果(PPL=86.77%，I=0.497 2)[11]和长白山区牛皮杜鹃(Rhododendronaureum)的研究结果(PPL=87.43，I=0.459 3)[9]，表明西藏地区雪层杜鹃在物种水平上具有较高的遗传多样性。在种群水平上，多态性位点百分比(PPL=63.36%)略低于秦岭地区秀雅杜鹃遗传多样性研究结果(PPL=77.56)，但是Shannon信息指数(I=0.280 3)和基因多样性指数(h=0.184 1)远低于秀雅杜鹃遗传多样性研究结果(I=0.640 9，h=0.472 5)，并且基因多样性指数小于Nybom统计的不同物种种群内基因多样性指标平均值h=0.220 0[24]，表明西藏地区雪层杜鹃在种群水平上遗传多样性较低，这区别于秦岭地区和长白山区其他杜鹃花种的研究结果。这可能是由西藏地区特殊的生境引起的，雪层杜鹃是灌丛群落的建群种，生长地海拔较高、分布范围广，遗传方向主要受环境因素制约。本试验检测的5个雪层杜鹃种群的多态位点百分率的变化趋势为工布江达县种群<米林种群<色季拉山种群<嘎隆拉种群<红拉山种群，基因多样性指数h和Shannon信息指数I的变化趋势一致均为工布江达县种群<米林种群<嘎隆拉种群<色季拉山种群<红拉山种群。这种变化趋势可能与种群地理分布区域的大小、生境环境和海拔有关。有研究表明，生活史、生活型、交配系统、环境包括人类活动以及自然环境都是影响植物种群遗传多样性的原因[9,24～25]。雪层杜鹃为矮小灌木，可自花异花授粉繁殖，也可以无性系繁殖。红拉山种群的各项指标都是5个种群中最高的，其中基因多样性指标h=0.263 9，大于不同物种种群内基因多样性指标平均值h=0.220 0，说明红拉山种群内具有较高的遗传多样性。红拉山种群的采样地是5个种群中海拔最高的，种群样本为低矮灌木丛，生长于山顶冠层，特殊的群落类型使得红拉山种群不受较高植物的阻碍，风媒、虫媒传粉可以顺利进行；雪层杜鹃具有分枝多、分枝稠密、常平卧成垫状生长，易产生无性繁殖；红拉山种群呈连续分布，这增强了种群内基因交流并且丰富了种群基因型；色季拉山种群生生长于山坡草甸冠层，呈片状连续分布，使得色季拉山种群内有较丰富的基因交流，遗传多样性仅次于红拉山种群；其余3个种群分布于林下，种群呈间断分布，采样种群在一定范围内隔离成一些小种群，这导致小种群内部基因交流频繁且容易进行并且阻碍了整个种群的有效基因交流，因此降低种群基因的多样性水平；嘎隆拉山种群生长地具有的多样的自然气候，可能是引起该种群遗传多样性水平较高的原因。

种群遗传分化系数是评价种群遗传结构的重要指标，不同物种在遗传结构和遗传分化上有很大不同[5,7]。地理因素是促使群体遗传分化的主要因素之一[7]，西藏地区山脉较多，海拔跨度大，气候类型丰富，导致种群间相互隔离并且可能引起种群间的遗传分化；种群大小也是引起种群间遗传分化的重要因素之一[26～27]；基因流也是引起群体遗传分化的重要因素之一，传粉和种子传播是植物基因流的2种主要形式[29]，雪层杜鹃为低矮灌木，生长在混交林下层时，花粉和种子传播距离受限，从而降低了不同群体间的基因交流，导致遗传分化出现；种群生长地域差异或海拔差异使得种群间缺乏有效的基因交流，从而引起种群间的遗传分化。POPGENE分析得出种群间总的遗传分化系数为Gst=0.324，大于长白山山区牛皮杜鹃种群间遗传分化系数[9]，表明5个雪层杜鹃种群间有显著的遗传分化。AMOVA分析的雪层杜鹃遗传变异分布格局结果显示种群间的变异率为36%，种群内的变异率为64%，说明雪层杜鹃在种群间存在一定的遗传多样性，但是主要存在于种群内，可以推测基因流可能是影响雪层杜鹃遗传分化的重要因素，雪层杜鹃的生境类型可能导致了生境片段化，从而引起种群内的遗传分化。

根据遗传一致度对5个雪层杜鹃进行UPGMA聚类分析以及地理距离与遗传距离的Mantle检验，结果表明该5个种群间的遗传分化程度与地理分布和海拔没有明显的相关性，这与赵冰等分析秦岭秀雅杜鹃遗传多样得到的结果一致[7]。但是长白山牛皮杜鹃遗传多样性分析中证明了种群间的遗传距离和海拔显著相关[9]，武夷山伯乐树(Bretschneiderasinensis)的种群间遗传距离和地理距离显著相关[5]，因此可以对雪层杜鹃种群的遗传多样性是否与海拔相关进行进一步研究。

3.2 雪层杜鹃种质资源开发和保护建议

藏东南、滇西北、川西南是中国杜鹃花集中分布地，也是杜鹃花属的现代分布中心[4]。近年来，全球变暖，藏东南冰川融化退缩，降水减少等气候变化可能影响到高山生态系统。另外，人类对大自然的开发也会损失植物野生种质资源。雪层杜鹃有较高的观赏价值和药用价值，是高海拔地区植物群落的重要组成部分，因此应对雪层杜鹃进行合理的开发和保护。有研究在藏东南高海拔地区发现一些国家重点保护野生植物，生长于杜鹃灌丛提供的庇护所内，因此建立高海拔杜鹃花属植物的就地保护基地可以为珍惜濒危植物的就地保护提供基础。研究结果显示红拉山种群具有较高的遗传多样性，可以对现有种群进行就地保护；其余4个种群的遗传多样性水平较低，建议在建立杜鹃花就地保护基地的同时可以迁地保护杜鹃花种质资源，促进其遗传多样性水平提高并防止种群消亡。西藏地区的雪层杜鹃在物种水平具有较高的遗传多样性，但是由于种群的生境片段化，降低了种群基因流，引起了种群遗传分化，因此对西藏地区的雪层杜鹃的保护提出以下建议：首先对该物种进行全面研究，其次确定合适的保育地点对杜鹃花进行就地保护，并对部分杜鹃花进行迁地保护试验，尽可能多地保护野生种群；其次进一步加强雪层杜鹃繁殖生物学、物种多样性的研究，积极增强合理的引种驯化和人工栽培雪层杜鹃的研究，为雪层杜鹃的合理开发和利用奠定基础。

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National Science Foundation(K305021401)

introduction：XU Jing-Jing(1990—),female,Current Master Students,Mainly engaged in garden plant germplasm resources research.

date:2016-08-30

AssessmentofGeneticDiversityofRhododendronnivaleinTibetan,ChinausingAFLPMarkers

XU Jing-Jing1ZHAO Bing1*ZHANG Liang-Ying2SHEN Hui-Fei1LI Hou-Hua1

(1.The College of Landscape Architecture and Arts,Northwest A&F University,Yangling 712100；2.College of agriculture and animal husbandry,Tibet University,Linzhi 860114)

To determine the correlation among genetic variations, the geographic location of a population, and factors that influence high-level genetic diversity, the genetic diversity of 135Rhododendronnivalesamples was studied using amplified fragment length polymorphisms(AFLP). A total of 273 amplification products were generated from 6 selective primer combinations, of which 85.71% were polymorphic. The results of POPGENE showed the change trends of the percentage of polymorphic(PPL), Nei’s genetic diversity(h) and Shannon’s index(I) were similar. The change trends of Nei’s genetic diversity(h) and Shannon’s index(I) were Gongbujiada

Tibetan;Rhododendronnivale;genetic diversity;AFLP;population

国家自然科学基金(K305021401)

徐静静(1990—)，女，硕士研究生，主要从事园林植物种质资源研究。

* 通信作者：E-mail:bingbing2003915@163.com

2016-08-30

* Corresponding author：E-mail:bingbing2003915@163.com

S685.21

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.01.012