基于高通量测序技术的美洲獾肠道微生物多样性分析

王志永 吴晓阳 张永宾

(1.石家庄市动物园管理处，石家庄，050200；2.曲阜师范大学生命科学学院，曲阜，273100)

鼬科(Mustelidae)动物是食肉目(Carnivora)中第一大科，包括25属，近70种动物，大部分的獾类在我国都有分布，为我们的珍稀野生动物保护提供了较为便利的数据来源。其中美洲獾属(Taxidea)同样属于鼬科，但是在中国却没有自然分布，为了更好地对鼬科动物进行整体数据的采集，我们需要对其进行数据的补充。美洲獾属属于鼬科、美洲獾亚科(Taxidiinae)。只包括1个种——美洲獾(Taxideataxus)，主要分布于北美洲中部和西南部的开阔草原、耕地和稀树草原。善捕食草原害鼠，对草原鼠害的控制起着无可替代的作用，但其习性又能破坏草场和农田。近年来由于人类活动和过度狩猎导致其种群数量明显下降，现已列入《世界自然保护联盟》(IUCN)ver 3.1：2008年哺乳纲红色名录低危(LC)。为了制止美洲獾数量的日益减少，需要对其进行保护。众所周知，肠道菌群对宿主的健康具有重要的作用，美洲獾同样如此。美洲獾的肠道环境是机体非常重要的微生态系统，肠道微生物对美洲獾的消化、免疫等功能发挥着至关重要的作用[1]。机体中的大多数部位都存在着一定数量的微生物，而肠道中的微生物因位置敏感生物多样性较高被人们广泛关注[2-3]。美洲獾肠道菌群多样性的探究方法非常多，早期主要采用传统培养的方法，但肠道中的微生物大多数都是无法被分离培养的，传统方法无法探究[4]。随着分子生物学的发展，出现了如末端限制性片段长度多态性(terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP)分析、变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)等方法，这些方法虽然能将一些厌氧菌识别出来，但研究技术的局限及小通量的数据使得我们无法获得较多的信息量，也无法更进一步地探究[5-7]。19世纪80年代以来，高通量测序技术的发展突飞猛进，该技术以其高通量、高准确性的优点被广大微生态科学家青睐[8]。近年来，高通量技术被广泛地应用于水体、土壤及粪便微生物研究中。但是，在国内利用高通量测序技术对健康美洲獾肠道微生物的研究实属罕见。本研究通过Illumina MiSeq平台进行细菌16SrDNA的V4高变区进行双端测序，快速、全面地鉴定健康美洲獾肠道微生物，为研究美洲獾肠道微生物的结构与其在肠道中的功能提供参考依据，为世界范围内的鼬科动物保护提供了可靠的理论支持。

1 材料与方法

1.1 肠道菌群基因序列的获取

美洲獾的肠道菌群高通量数据从NCBI网站下载，所有序列以FASTQ文件格式保存。对5个个体重新编号为MZH1-MZH5。美洲獾的新鲜粪便样本来自于美国某动物园，其食物为常规饲养饲料，采样前并未进食任何影响肠道菌群的抗生素等药物。测序采用Illumina MiSeq高通量平台进行双端测序。

1.2 数据分析

根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样品数据，截去Barcode和引物序列后使用FLASH(V1.2.7，http：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/)对每个样品的reads进行拼接，得到的拼接序列为原始Tags数据(Raw Tags)；拼接得到的Raw Tags，需要经过严格的过滤处理得到高质量的Tags数据(Clean Tags)。参照Qiime(V1.7.0，http：//qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)的Tags质量控制流程，进行如下操作：a)Tags截取：将Raw Tags从连续低质量值(默认质量阈值为≤19)碱基数达到设定长度(默认长度值为3)的第一个低质量碱基位点截断；b)Tags长度过滤：Tags经过截取后得到的Tags数据集，进一步过滤掉其中连续高质量碱基长度小于Tags长度75%的Tags。经过以上处理后得到的Tags需要进行去除嵌合体序列(http：//www.drive5.com/usearch/manual/chimera_formation.html)的处理，Tags序列通过(UCHIME Algorithm，http：//www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html)与数据库(Gold database，http：//drive5.com/uchime/uchime_download.html)进行比对检测嵌合体序列，并最终去除其中的嵌合体序列，得到最终的有效数据(Effective Tags)。利用Uparse软件(Uparse v7.0.1001，http：//drive5.com/uparse/)对所有样品的全部 Effective Tags进行聚类，默认以97%的一致性(Identity)将序列聚类成为OTUs(Operational Taxonomic Units)，同时会选取OTUs的代表性序列，依据其算法原则，筛选的是OTUs中出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列。对OTUs代表序列进行物种注释，用Mothur方法与SILVA(http：//www.arb-silva.de/)的SSUrRNA数据库进行物种注释分析(设定阈值为0.8～1)，获得分类学信息并分别在各个分类水平：kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成。最后对各样品的数据进行均一化处理，以样品中数据量最少的为标准进行均一化处理，后续的Alpha多样性分析和Beta多样性分析都是基于均一化处理后的数据。使用Mothur软件计算Chao1，Shannon，Simpson，ACE，Goods-coverage指数，使用R软件(Version 2.15.3)绘制稀释曲线。

2 结果与分析

2.1 样品序列及OTUs

本研究基于Illumina高通量测序技术对5只健康美洲獾肠道菌群16S rDNA V4区进行测序，按照97%的阈值对OTUs进行归类，共获得140922条tags，平均tags为(27964±757)条，并归类于80个OTUs。其中，有效序列数量最高的是样品MZH5，最低的是MZH3，相差1661条。

2.2 Alpha多样性分析

采用Alpha多样性指数对各样品的丰富度和多样性进行比较。从图1可以看出，稀释曲线随着测试深度的不断增加逐渐上升，并趋于平缓，说明测序深度较为合理，虽然大多数菌群被覆盖，但仍有少量细菌未被测出。

Alpha多样性指数分析结果表明(表1)，美洲獾的菌群物种丰富度和多样性都相对较高。其中，样品中菌群丰富度指数较高的为MZH1和MZH2(Ace：321.4，334.1和Chaol：209.3，179.5)，最低的为MZH4(Ace值131.4和Chaol值110.9)。同时我们对5个样品的菌群多样性也进行了分析。Shannon指数越大表示群落多样性越高，MZH3的Shannon值最大0.59，最低的为0.56。但是多样性指数Simpson值各样品之间相差不大。Coverage指数是样品的测序深度也表明样品的覆盖率，5个样品的Coverage均在99.8%以上，表明样品中序列未被检测到的可能性较低。

表1 美洲獾肠道菌群多样性指数

Tab.1 The microbiome diversity index of American badger

2.3 物种注释

在门水平和属水平对样品进行物种注释分析。15个样品共获得所有样品共含有10个菌门，74个菌属。此外，还有大量的无法鉴别菌群的序列。

在门水平上，含量大于1%有5个菌门，分别为：厚壁菌门(Firmicutes)，平均含量为73.01%；拟杆菌门(Bacteroidetes)，平均含量为9.31%；变形菌门(Proteobacteria)，平均含量为7.44%；放线菌门(Actinobacteria)，平均含量为3.08%；疣微菌门(Verrucomicrobia)，平均含量为1.66%。属水平含量大于1%的菌属共有21个，其中梭菌属系列(Clostridium_sensu_stricto、Clostridium_XI、Clostridium_IV、Clostridium_XIVb、Clostridium_XIVa、Clostridium_XVIII)，平均含量为19.82%；链球菌属(Streptococcus)，平均含量为4.59%；Cellulosilyticum，平均含量为3.31%；普氏菌属(Prevotella)，平均含量为2.65%；Butyricicoccus，平均含量为2.40%；瘤胃球菌属(Ruminococcus)，平均含量为1.89%；不动杆菌属(Acinetobacter)，平均含量为1.71%；乳酸菌属(Lactobacillus)，平均含量为1.45%；Hespellia，平均含量为1.23%；平均含量为1.20%的菌属有：变形杆菌属(Proteus)、Akkermansia、葡萄球菌属(Staphylococcus)、气球菌属(Aerococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、Lachnospiracea_incertae_sedis、Turicibacter。

3 讨论

对健康美洲獾的肠道菌群开展的高通量测序结果表明：5只健康美洲獾的肠道菌群的种类和数量不完全相同，可能的原因是美洲獾的体质、肥胖程度及饮食量等差异造成。稀释曲线可直接反映测序数据量的合理性，并间接反映样品中物种的丰富程度，当曲线趋向平坦时，说明测序数据量渐进合理，更多的数据量只会产生少量新的物种，测试结果具有一定的随机性。研究表明，肠道菌群的丰富度和多样性与年龄和性别也有关系，所以其年龄和性别也可能是造成差异的原因[9]。即使在相同饲养环境下，也会存在个体差异。本次研究检测结果覆盖了大多数的菌种，所以本次试验具有较好的代表性。

通过物种注释可以看出，含量排在前五的门分别是厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门和疣微菌门，与其他鼬科动物肠道菌群的研究结果相似[10]。共享核心菌群比较结果显示，除疣微菌门外，其他菌门都是共享核心菌门。厚壁菌门是健康美洲獾的肠道中含量最多的菌群。厚壁菌门在肠道或粪便中作为主要菌门在猫、狗、马等动物中也有报道。据报道，厚壁菌门与脂肪、蛋白的消化有关，美洲獾作为以啮齿动物和其他小型哺乳动物为食主要食物的兽类，厚壁菌门对其营养消化吸收有帮助作用[11-14]。不同个体门水平和属水平上微生物百分比差异都较小。本次试验测得到的菌种与紫貂(Marteszibellina)等的结果存在差异，造成差异的原因除饲养环境、品种和研究方法不同外，也可能是饲粮配方不同造成的差异[8]。研究表明，饮食差异对动物的健康和代谢有影响，而且可以改变动物的肠道微生物。本实验所测样品数较少，要总结出美洲獾肠菌群变化的详细规律，以及在不同生长阶段中发挥的作用有无变化等，还有待进一步研究。