杭州动物园部分野生动物弓形虫感染情况调查

陈玎玎 黄淑芳 王才益 应志豪 龚利洋 汪丽芬

(杭州动物园，杭州，310008)

弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种可以感染包括鸟类、人类及兽类在内的几乎所有温血性动物的机会致病原虫，呈世界性流行[1-2]。人或动物误食被弓形虫卵囊、弓形虫包囊、速殖子等污染的食物或者水，均有可能感染弓形虫[3-4]。弓形虫对人和动物危害严重，可导致孕妇流产、死胎、先天性畸形，也会造成免疫力低下[5]。研究发现，重度的弓形虫感染可导致澳大利亚有袋目(Marsupialia)、新世界猴(Platyrrhini)、狐猴(Lemuridae)、兔狲(Otocolobusmanul)、金丝雀(Serinuscanaria)类等野生动物死亡[2，5-6]。野生动物弓形虫慢性感染时一般无明显症状，这不仅给患病动物的诊断带来极大的困难，而且对公共安全存在潜在的威胁，因此，对野生动物弓形虫感染情况的调查显得尤其重要。

国内动物园总量约200家，然而在野生动物感染弓形虫方面的调查相对较少，国内现报道的仅有北京、成都、福州、上海，感染率在1.9%～47.46%[7-13]之间，成都大熊猫繁育基地、黑龙江东北虎林园、广东等地也有零星发现[14-16]。另外，青海、新疆、北京等地分别对部分高原动物、啮齿动物及鸟类进行调查，感染率分别为10.61%，0.52%(1/192)及27.48%[17-19]。杭州动物园首次对园内野生动物进行弓形虫血清学和分子生物学调查，以期为野生动物弓形虫病的诊断和治疗提供指导，同时为同行业提供指导和借鉴。

1 材料与试剂

1.1 野生动物血清及全血样本

在2015～2017年期间共采集杭州动物园35种野生动物血清118份，其中哺乳纲食草动物50份、食肉动物43份、灵长类动物6份、禽类动物19份，无菌采集血液分离出血清。采集到全血13份，其中哺乳纲食草动物8份，食肉动物1份，灵长类3份，同样-20℃冰箱保存。

1.2 实验试剂设备

1.2.1 试剂

ID Screen toxoplasmosis indirect Multi-species试剂盒购自IDvet innovative Diagnostics，TIANamp Blood DNA Kit 血液基因组DNA提取试剂盒购自天根生物有限公司。

1.2.2 设备

酶标仪购自Molecular Devices公司、Eppendorf排枪、Eppendorf移液枪、恒温箱等。

2 弓形虫抗体检测方法

2.1 采用间接酶联免疫试验(ELISA)法原理

微量板已经用弓形体P30抗原包被，加入样本和对照后，经过孵育，若样本中含有抗体，就会形成“抗原-抗体”复合物。通过第1次洗板后，再加入过氧化物酶结合物，含抗体样本孔内将形成“抗原-抗体-酶”的复合物。经过第2次洗板，加入含底物TMB液。若存在抗体，溶液将呈现蓝色，并在加入终止液后转为黄色；若无抗体存在将不呈现任何显色反应，呈色反应与样本中抗体含量成正比。在450 nm波长检测OD值，计算每个样本S/P的百分比，即S/P%=(OD样本-OD阴性对照)/(OD阳性对照-OD阴性对照)。当S/P%≤40%时为阴性，当40%

2.2 检测步骤

样本准备：保证不同样品孵育时间一致，用一个空白96孔板对样本和对照样本用样品稀释液2进行1∶10的稀释。

洗涤液准备：用蒸馏水按照1∶20的比例稀释浓缩洗液，每个样本进行2次洗板需要洗涤液600 μL，根据样本的数量计算配制的量。

酶结合物准备：用样品稀释液3按1∶10的比例稀释。

检测：根据样本量取出包被好的微量孔的个数，对照孔均设2个，每孔加稀释过的样本液体100 μL，在21 ℃(±5℃)下孵育(45±4)min后，进行洗板，要洗3次，最后一次在甩掉洗涤液后要吸去剩下的液体。以较快的速度加入稀释好的酶结合物液体100 μL，最好采用连续加液器或排枪，在21 ℃(±5℃)下再孵育(30±3)min后，进行第2次洗板，同上洗3次。最后每孔加入100 μL底物，孵育(15±2)min后每孔加入100 μL终止液，然后在酶标仪的450 nm波长读取OD值。

3 弓形虫分子生物学鉴定方法

3.1 DNA的提取

使用TIANamp Blood DNA Kit 血液基因组DNA提取试剂盒对全血样本进行DNA提取。

3.2 PCR扩增

参照袁恒青等[20]的方法，进行PCR扩增。反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳后观察。

4 结果及分析

4.1 弓形虫抗体检测结果

118份血清弓形虫抗体IgG检测结果为，总体阳性率21.19%(25/118)，其中食草性动物阳性率32.0%(16/50)，食肉性动物阳性率18.60%(8/43)，灵长类动物阳性率16.67%(1/6)，禽类动物未检测到阳性抗体(0/19)。通过SPSS软件采用卡方检验分析4类动物样本数与阳性样本数差异性，食草性动物与禽类动物弓形虫抗体IgG差异极显著(x2=7.650，P<0.01)，食肉性动物与禽类动物形虫抗体IgG差异显著(x2=3.089，P<0.05)。具体情况见表1。

表1 35种野生动物弓形虫血清学抗体IgG检测结果

续表1

注：表格中“/”表示S/P<50%(阴性)

Note：The“/”meansS/P<50% in the table

4.2 弓形虫抗原分子生物学检测结果

对从全血样本中提取的DNA进行PCR扩增，19号样本(金钱豹)电泳成像结果为弱阳性，其余样本均为阴性(图1)。

图1 PCR扩增电泳结果Fig.1 Result of PCR amplication 注：M为2000 Marker(2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp)，泳道1为阳性对照，2为阴性对照，7～11，13～14，17～22为待测样本，分别为黑猩猩、黇鹿、斑马、梅花鹿、黇鹿、梅花鹿、黇鹿、黑猩猩、斑马、金钱豹、黑猩猩、黇鹿、黇鹿，其余编号样本与本次调查无关 Note：M：2000 Marker(2000 bp，1000 bp，750 bp，500 bp，250 bp，100 bp)；1：Positive control；2：Negative control；7-11，13-14，17-11：chimpanzee，fallow deer，zebra，sika deer，fallow deer，sika deer，fallow deer，chimpanzee，zebra，leopard，chimpanzee，fallow deer，fallow deer，respectively.Other samples have nothing to do with this survey

5 讨论

弓形虫IgG抗体一般在感染后1～2周出现阳性，3～5周抗体效价达到高峰，并可维持多年。目前，弓形虫血清型检测的方法主要有改进凝集检测法(MAT)、间接红细胞凝集检测法(IHAT)和酶联免疫吸附实验检测法(ELISA)等[21]。张述义等[12]用ELISA、MAT和IHAT 3种方法检测动物与人血清的弓形虫抗体，结果显示：这3种检测方法对其弓形虫阳性检出率无显著差异，都可用于弓形虫血清流行病学调查。本试验采用ELISA法检测野生动物血清抗体。

杭州动物园118份野生动物检测结果总体阳性率为21.19%，与国内成都、上海和福州动物园等[7-8，10-11]和国外部分动物园[3，6，22-23]弓形虫检测相比，感染率略低。其中，食草动物感染率显著高于其他几类动物，羊驼尤甚，这可能与场馆设计以及园内存在的流浪猫有关。以羊驼为例，羊驼的外场为开放式的生态化展示结构，没有笼网等物理隔离提高了动物的展示效果，但也导致了流浪猫可以自由进出笼舍。杭州动物园曾对区域内流浪猫的血清样本进行过检测，发现其弓形虫抗体IgG阳性率约为50%，阳性率高。猫科(Felidae)动物为弓形虫重要的终宿主，弓形虫卵囊会随猫科动物的粪便在环境中传播[2]。流浪猫弓形虫的感染率处于较高水平，在弓形虫的传播过程中发挥着重要作用[13，24]，羊驼很有可能因采食到被弓形虫卵囊污染的食物而感染。以上情况都提示我们应严格控制流浪猫数量，并加强对动物笼舍的消毒管理，切断传播途径。

对于禽类弓形虫的检测，多篇文献检测结果间存在差异。Tidy等[3]对葡萄牙的两所动物园的检测显示22.1%禽类弓形虫检测为阳性，Lopes等[4]对葡萄牙部分区域的野生动物进行弓形虫检测显示50%的禽类弓形虫检测为阳性；Minervino等[6]对巴西部分区域的野生动物弓形虫的检测结果显示未发现阳性结果；胡春梅等[19]对北京地区131只野生鸟类的弓形虫血清学检测阳性率为27.48%。周忠勇等[25]曾对上海动物园内20种36份鸟类血清进行检测，阳性率11.11%。Huang等[26]使用PCR对国内不同地区178只野生鸟类肌肉样本检测，阳性率2.24%(4/178)。对于本实验中样本未检测出抗体阳性结果，可能与本次采集禽类样本量有限(仅以蓝孔雀、蓑羽鹤及小天鹅为主)有关，也有杭州动物园禽类弓形虫感染率较低的可能，其深层次原因有待进一步调查。

PCR检测仅有1个阳性的结果，该个体抗体检测也为阳性，确认其处于感染期。其余抗体检测阳性，分子生物学检测阴性显示动物可能曾经受到过感染。对于本次检测中确诊处于弓形虫病感染期的金钱豹个体，虽然其并未进入繁殖梯队，但作为弓形虫感染的终末宿主，为保障动物福利、目前已针对性用药。另外，因弓形虫病经治疗后个体极易成为带虫者，在日常饲养管理中，要严格注意清洁消毒，预防交叉感染和重复感染。有报道未经加工的生肉是造成弓形虫在人群中传播的主要原因[27]，再次提示我们要做好消毒工作。