海南岛白唇竹叶青蛇扩散的初步研究

王湘君 陈 文 林炽贤 林杰曼

(1.海南热带海洋学院生命科学与生态学院，两栖爬行动物研究省级重点实验室，三亚，572022；2.南京师范大学生命科学学院，南京，201146；3.海南热带海洋学院海洋科学技术学院，三亚，572022)

白唇竹叶青蛇(Trimeresurusalbolabris)，白唇腺蝮隶属于蛇亚目(Serpentes)蝰科(Viperiae)竹叶青蛇属，栖息于平原、丘陵或低山区，各种水域附近的灌丛和杂草上。国内分布于澳门、福建、广东、广西、贵州、海南、湖南、江西、台湾、香港、云南；国外分布于尼泊尔、印度北部、缅甸、泰国、印度支那、马来西亚、印度尼西亚[1-2]。

Avise首次提出把动物学、遗传学、系统学、地理学和分子生物学的理论和方法相结合，构建“种内系统发育地理学”。其方法论基础是动物线粒体DNA单倍型的系统发育关系及其群体动力学[3-5]。运用亲缘地理学的理论与方法，揭示种群的历史，例如：发生、建群、发展、隔离、分化、迁移、扩散、瓶颈和灭绝；在种内水平上，阐述了种群演化历程，及其与地理学的关系。其中，12S、16S、Cytb、ND2、ND4、D-loop、COI等序列，是分子标记上运用比较广的几个基因序列[6-10]。

作者通过研究白唇竹叶青蛇12S、16S、Cytb、ND4四个线粒体基因部分序列，分析诸多单倍型序列彼此之间的亲缘以及变异程度关系，推断竹叶青蛇的扩散方向和地理分化中心。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 PCR实验所用标本

采集来自海南产白唇竹叶青蛇共12个个体，其中3个采自乐东县(西南部) 编号为C01，C02，C03；2个采自东方市(西部)编号为C04，C05；4个采自昌江县(西北北部)编号为C06，C07，C08，C09；采自三亚市(南部)、陵水县(东南部)、琼海市(东部)各1个，分别编号为C10，C11，C12。

1.1.2 从网上下载的竹叶青蛇序列

表1 GenBank下载的序列

Tab.1 The sequences downloaded from GeneBank

1.2 实验方法

采集标本运用PCR法分别扩增12S、16S、Cytb、ND4四个基因片段，并测列。采用通用引物，引物序列和PCR扩增条件如下表。

表2 引物设计图表

Tab.2 Design of primer

表3 PCR反应条件

Tab.3 Reaction requirement for PCR

1.3 数据分析

利用12S、16S、Cytb、ND4基因序列的单倍型判别相对原始及进化的序列来确定迁徙扩散路线。采用DNASTAR软件ClustalX程序排列DNA同源序列后，人工逐项核查，将全部序列都视为无序特征。再将12S、16S、Cytb、ND4基因序列片段的seq文件分别加载到MAGA6.0软件后，根据其碱基突变位点数逐步比较排查，从而筛选出较为原始的单倍型序列，作为起源中心。

2 结果与分析

2.1 基因序列的核苷酸组成

表4 竹叶青蛇属蛇类基因序列的核苷酸组成(bp)

Tab.4 Nucleotide composition of genus Trimeresurus sequence(bp)

从测定结果可以看出，白唇竹叶青蛇的碱基数A+T的含量都明显高于碱基数G+C的含量，这与脊椎动物线粒体DNA的L链碱基组成相一致[11-12]。A的含量明显偏高，而G明显偏低，与其他蛇类此片段碱基组成比例相当[11，13-14]。

2.2 白唇竹叶青蛇扩散路线

样本产自海南岛的8个市县，按地理距离和地理相似性被划分在5个地理单元内地理分布(图1)：昌江县、东方市为西部单元(Western unit：Changjiang，Dongfang)，琼海市为东部单元(Easternmost unit：Qionghai)；海口市为北部单元(Northern unit：Haikou)，乐东县、三亚市、陵水县为南部单元(Southern unit：Ledong，Sanya，Lingshui)，白沙县为中部单元(Central unit：Baisha)。

基于12S、16S、Cytb、ND4的基因序列片段，采用DNASTAR软件ClustalX程序排列DNA同源序列后，再通过人工详细核查，将全部序列都视为无序特征。再将12S、16S、Cytb、ND4基因序列片段的seq文件分别加载到Megalin软件后，根据其碱基突变位点数逐步比较排查，从而筛选出较为原始的单倍型序列，再根据所示遗传距离图，逐步有选择性的局部序列比对和原始序列的比对，寻找突变位点、突变碱基数目，尝试判断突变方向，绘制出单倍型简约网络图[15]，如图2(a)、3(a)、4(a)、5(a)所示。

2.2.1 基于12S基因，白唇竹叶青蛇扩散路线

基于12S基因下，获得分别产自海南岛西部、东部、南部单元共12条白唇竹叶青蛇基因序列片段，经详细的剪辑比对排查发现393个碱基位点中有15个突变位点，共定义了9个单倍型。由图2(a)-2(b)可知，基于12S基因下的单倍型网络呈现出较清晰的星状聚类图。其中产自海南东方的C04和产自海南昌江的C05、C08的白唇竹叶青为同一单倍型，产自海南乐东的C01、C03及产自海南三亚的C10为同一单倍型，其他序列均为“孤序列”，即：单独一个序列对应一个单倍型[15]。编号为C04、C06、C08的白唇竹叶青蛇相较原始且占主导优势，因此为中央单倍型，其他单倍型均以中央单倍型进行扩散进化。其中编号C11、C02与中央单倍型相较远，均相差4个单倍型，因采集地点及个数较少，大多数的过渡类群的单倍体无法获取，均以黑点表示未观察到的中间单倍型。

根据图2(a)，绘制出基于12S基因下，白唇竹叶青蛇扩散路线图2(b)。由图可知，海南产白唇竹叶青蛇总体呈现出由西部向东部扩散的趋势，其起源中心分别是海南省的昌江县、东方市这两个西线市县。根据单倍型可知，C07、C09可能由C04、C06、C08扩散进化得到，但C07、C09与C06、C08均产自昌江县，地理位置相较为近，因此C07由C06、C08扩散进化得到的可能性大。同理，C04与C05均产自东方市，C05由C04扩散进化得到的可能性大。C05是C04扩散进化到C01、C03、C10的过渡类群，C07是C06、C09扩散进化到C01、C03、C10的过渡类群。

图1 海南岛白唇竹叶青蛇采集样点Fig.1 Map of the sampling localities of Hainan Trimeresurus albolabris 注：黄色三角形编号1～10分别对应B01～B10号样本蛇；红色三角形1～12分别对应C01～C12号样本蛇 Note：Yellow triangle No.1-10 corresponds to sample snake B01-B10，red triangle No.1-12 corresponds to sample snake C01-C12，respectively

图2(a) 基于12S基因，白唇竹叶青蛇统计简约网络图Fig.2 (a) The statistics simple network diagram of Trimeresurusalbolabris in Hainan based on 12S gene 注：未观察到的中间单倍型用黑点表示，每一步变异用或者较长或者较短的连接单倍型的线段表示，包括观察到的和未观察到的单倍型，圆圈的大小大致表示共享该单倍型的个体的数量[15] Note：Unobserved intermediate haplotypes are denoted by black dots，and each variation is denoted by lines of either longer or shorter connected haplotypes，including observed and unobserved haplotypes.The size of the circle roughly denotes the number of individuals sharing the haplotype[15]

图2(b) 基于12S基因，白唇竹叶青蛇扩散路线图Fig.2 (b) The spread route map of Trimeresurus albolabris in Hainan based on the 12S gene 注：红色小三角形1～12分别对应C01～C12号样本蛇 Note：Red small triangle No.1-12 corresponds to sample snake C01-C12

图3(a) 基于16S基因，白唇竹叶青蛇统计简约网络图Fig.3 (a) The statistics simple network diagram of Trimeresurus albolabris in Hainan based on 16S gene 注：未观察到的中间单倍型用黑点表示，每一步变异用或者较长或者较短的连接单倍型的线段表示，包括观察到的和未观察到的单倍型，圆圈的大小大致表示共享该单倍型的个体的数量[15] Note：Unobserved intermediate haplotypes are denoted by black dots，and each variation is denoted by lines of either longer or shorter connected haplotypes，including observed and unobserved haplotypes.The size of the circle roughly denotes the number of individuals sharing the haplotype[15]

图3(b) 基于16S基因，白唇竹叶青蛇扩散路线图Fig.3 (b) The spread route map of Trimeresurus albolabris in Hainan based on the 16S gene 注：红色小三角形1～12分别对应C01～C12号样本蛇 Note：Red small triangle No.1-12 corresponds to sample snake C01-C12

2.2.2 基于16S基因，白唇竹叶青蛇扩散路线

基于16S基因，获得分别产自海南岛西部、东部、南部单元共9条白唇竹叶青蛇基因序列片段及产自中国香港的1条白唇竹叶青蛇基因序列片段。经详细的比对排查发现358个碱基位点中有16个突变位点，共定义了7个单倍型。由图3(a)可知，基于16S基因下的单倍型网络与基于12S基因下的单倍型网络相似，均呈现出较清晰的星状聚类图。其中产自海南乐东的C01、东方的C04、海南昌江的C08的白唇竹叶青为同一单倍型，且相较其他白唇竹叶青为原始，占主导优势，因此为中央单倍型，其他单倍型均以中央单倍型进行扩散进化。产自海南琼海的C12与产自香港的HK为同一单倍型，其与中央单倍型相距远，相隔7个单倍类型。其他序列均为“孤序列”(singletons)，其中C11与中央单倍型差9个单倍型。因采集地点及个数较少，所有的过渡类群的单倍体无法获取，均以黑点表示未观察到的中间单倍型。

图4(a) 基于Cyt b基因，白唇竹叶青蛇统计简约网络图Fig.4(a)The statistics simple network diagram of Trimeresurusalbolabris in Hainan based on Cyt b gene 注：未观察到的中间单倍型用黑点表示，每一步变异用或者较长或者较短的连接单倍型的线段表示，包括观察到的和未观察到的单倍型，圆圈的大小大致表示共享该单倍型的个体的数量[15]. Note：Unobserved intermediate haplotypes are denoted by black dots,and each variation is denoted by lines of either longer or shorter connected haplotypes,including observed and unobserved haplotypes.The size of the circle roughly denotes the number of individuals sharing the haplotype[15]

图4(b) 基于Cyt b基因，白唇竹叶青蛇扩散路线图Fig.4(b)The spread route map of Trimeresurus albolabris in Hainan based on the Cyt b gene 注：黄色三角形编号1～10分别对应B01～B10号样本蛇，红色三角形1～12分别对应C01～C12号样本蛇。 Note：Yellow triangle No. 1-10 corresponds to sample snakes B01-B10 and red triangle No.1-12 corresponds to sample snakes C01-C12,respectively

图5(a) 基于ND4基因，白唇竹叶青蛇统计简约网络图Fig.5(a)The statistics simple network diagram of Trimeresurusalbolabris in Hainan based on ND4 gene 注：未观察到的中间单倍型用黑点表示，每一步变异用或者较长或者较短的连接单倍型的线段表示，包括观察到的和未观察到的单倍型，圆圈的大小大致表示共享该单倍型的个体的数量[13] Note：Unobserved intermediate haplotypes are denoted by black dots,and each variation is denoted by lines of either longer or shorter connected haplotypes,including observed and unobserved haplotypes.The size of the circle roughly denotes the number of individuals sharing the haplotype[13]

图5(b) 基于ND4基因，白唇竹叶青蛇扩散路线图Fig.5(b)The spread route map of Trimeresurus albolabrisin Hainan based on the ND4 gene 注：黄色三角形编号1～10分别对应B01～B10号样本蛇，红色三角形1～12分别对应C01～C12号样本蛇 Note：Yellow triangle No.1-10 corresponds to sample snakes B01-1B10, red triangle No.1-12 corresponds to sample snakes C01-C12,respectively

根据图3(a)，绘制出基于16S基因下，白唇竹叶青蛇扩散路线图3(b)。由图可知，海南产白唇竹叶青蛇总体呈现出由西部向东部扩散的趋势，其起源中心分别是海南省的昌江县、东方市、乐东县这3个西线市县，这与基于12S基因下，所得的起源中心为昌江县、东方市相似。根据单倍型可知，C09可能由C01、C04、C08扩散进化得到，但C09与C08均产自昌江县，地理位置相较为近，因此C09由C08扩散进化得到的可能性大。同理，C02与C01均产自乐东县，地理位置近，C02由C01扩散进化得到的可能性大。

2.2.3 基于Cytb基因，白唇竹叶青蛇扩散路线

基于Cytb基因下，获得分别产自海南岛东部、南部、北部单元共13条白唇竹叶青蛇基因序列片段及产自中国香港的1条白唇竹叶青蛇基因序列片段。经详细的比对排查发现308个碱基位点中有10个突变位点，共定义了5个单倍型。由图4(a)可知，基于Cytb基因下的单倍型网络与基于12S、16S基因下的单倍型网络相似，均呈现出较清晰的星状聚类图。其中产自海南乐东县的C01、白沙县的B10、海口市的B01、B02、B03及产自陵水县的B04、B05、B06、B07、B08、B09为同一单倍型，且相较其他白唇竹叶青为原始，占主导优势，因此为中央单倍型，其他单倍型均以中央单倍型进行扩散进化。产自海口市的B03与产自香港的HK为同一单倍型，其与中央单倍型相隔1个单倍类型。其他序列均为“孤序列”0，其中C10与中央单倍型相距最远差6个单倍型。因采集地点及个数较少，所有的过渡类群的单倍体无法获取，均以黑点表示未观察到的中间单倍型。

根据图4(a)，绘制出基于Cytb基因下，白唇竹叶青蛇扩散路线图4(b)。由图可知，海南产白唇竹叶青蛇总体呈现出由西部向东部扩散的趋势，其起源中心分别是海南省的海口市、白沙县、乐东县、陵水县这4个市县，起源中心相对分散，这可能与没测序出产自海南岛西部单元的蛇序列有关。根据单倍型亲缘地理位置可知，B03由B01、B02扩散进化得到的可能性比较大，C11由B04、B05、B06、B07、B08、B09扩散进化得到的可能性大。

2.2.4 基于ND4基因，白唇竹叶青蛇扩散路线

基于ND4基因下，获得分别产自海南岛西部、东部、南部、北部单元共21条白唇竹叶青蛇基因序列片段及产自中国香港的1条白唇竹叶青蛇基因序列片段。经详细的比对排查发现666个碱基位点中有13个突变位点，共定义了9个单倍型。由图5(a)可知，基于ND4基因下的单倍型网络与基于12S、16S、Cytb基因下的单倍型网络相似，均呈现出较清晰的星状聚类图。其中产自海南东方市的C05、昌江县的C08、C09为同一单倍型，且相较其他白唇竹叶青为原始，占主导优势，为中央单倍型，其他单倍型均以中央单倍型进行扩散进化。B01、B02、B04、B05、B07、B08、B09、B10、C12、HK为同一单倍型，其与中央单倍型相差4个单倍类型且是中央单倍型扩散进化为B03的过渡类群单倍型。C03、C10、C11为同一单倍型其与中央单倍型相隔2个单倍类型且是中央单倍型扩散进化为C02的过渡类群的单倍型。C06是中央单倍型扩散进化为C01的过渡类群的单倍型。因采集地点及个数较少，一部分的过渡类群的单倍体无法获取，均以黑点表示未观察到的中间单倍型。

根据图5(a)，绘制出基于ND4基因下，白唇竹叶青蛇扩散路线图5(b)。由图可知，海南产白唇竹叶青蛇总体呈现出由西部向东部扩散的趋势，其起源中心分别是海南省的昌江县、东方市这两个西线市县。根据单倍型及地理亲缘关系可知，C06、C07由C08、C09扩散进化得到的可能性较大，C04由C05扩散进化得到的可能性大，C02由C03扩散进化得到的可能性大，B03由B01、B02扩散进化得到的可能性大。

3 讨论与结论

根据系统发育的分枝格局来推测种群的扩散线路和方向，有很多成功的示例[16]，特别适合于对岛屿种群和扩散能力较弱的两栖爬行动物种群的研究[17]。

由图可知，基于12S、16S、Cytb、ND4基因序列片段的海南产白唇竹叶青蛇单倍型网络图均显示了较清晰的星状聚类图。暗示了局部种群可能的地理起源和较距离的迁移事件，也证明了本研究的地理采样有一个较好的覆盖度，但因获取的个体数目较少以致一部分的单倍型过渡类群无法获取，均以黑点表示未观察到的中间单倍型。基于不同的基因序列得到的起源中心存在差异，但总体扩散进化水平均呈现出由西部单元向东部单元扩散的趋势。但仍无法推断出海南产白唇竹叶青蛇样本与中国大陆、东南亚白唇竹叶青蛇的扩散方向和较为准确的起源地点。虽然海南岛的气候地理条件非常适合竹叶青蛇的生活习性，但是海南岛与大陆存在着无可争议的地理隔离。

DNA不仅是主要的遗传物质，同时也是生物进化史的重要记录者[18]。与核基因组相比，线粒体基因沿着一条直接而又简单的路线进化，可由后代追溯到单一祖先；因此使得该分子适合用于亲缘地理学研究和种群[15，19]。ND2和D-loop区域又因为进化速率快最早成为该领域研究热点[15]。Cytb基因在线粒体中，进化速率中等[13]，为常被用作分子标记的典型基因。但本实验所获的Cytb基因单倍型较少，待获取更多样本后，进一步分析。ND4基因进化速率相对较快[6-7，10]，且PCR实验条件要求很低，因此经常用于种下分子研究。本实验获取的单倍型中，个体数最多的单倍型并未处于变化的中心区域，这与采样点少、样本随机性较强有关。

就本实验中的12S、16S、Cytb、ND4基因序列片段而言，12S基因和16S基因的效果相对较好。其处于星图的中心单倍型个体相对较多，拓扑结构清晰，且两个基因的星图一致性较高。由于本实验样本量少且讨论的地域面积不大，进化速率相对较慢的12S和16S基因[8-9]，呈现出更清晰的结果。

竹叶青常生活于丘陵及山区，栖于溪边灌丛、竹林、壁岩上或石缝间，喜阴雨天气活动[1-2]。而海南岛地势为四周低中间高，呈现出弯隆形态，其是由山地、丘陵、盆地、平原构成阶梯式环形层状地貌[20]。再根据海南岛历年的降雨量，发现海南东部地区的降雨量远远多于海南岛西部地区[21-22]。因此，推断海南产白唇竹叶青蛇由西部地区向东部地区扩散，寻求更适宜的栖息环境。或许正是因海南岛适宜的气候及地理条件使得白唇竹叶青蛇能够在此大量繁殖，迅速扩大种群数量，丰富了白唇竹叶青蛇的基因库，但因盆地、平原等居民密集区对白唇竹叶青蛇的大量捕食也可能是造成白唇竹叶青蛇数目锐减，而山地、丘陵等居民稀疏区多发现竹叶青蛇的原因之一。

因此作者得出初步结论，从亲缘地理学上分析，海南产白唇竹叶青蛇整体呈现出西部地区往东部地区迁徙扩散。