葡萄酒冷稳定测试方法及研究进展

时间：2024-05-25

李秀秀，夏广丽*

（滨州医学院药学院（葡萄酒学院），山东烟台 264003）

葡萄酒中天然存在酒石酸盐，主要成分包括酒石酸氢钾（KHT）和酒石酸钙（CaT）。葡萄汁经发酵转变成酒后，其中的酒石酸盐处于饱和状态，易随温度等条件的变化而析出，形成晶体沉淀[1]。葡萄酒中的沉淀对于消费者来说是不可接受的质量缺陷，所以生产上通过特殊工艺处理来保证酒的冷稳定性（Cold Stability）。CaT的溶解度受酒精度的影响显著，温度变化对其影响有限；而KHT的溶解度同时受温度和酒精度的影响[2-3]，且含量占酒石酸盐的绝大部分，是影响葡萄酒冷稳定的主要因素。

葡萄酒KHT稳定性处理工艺有两大类型：（1）基于诱导的二次成核动力学的静态和动态的“减法”过程，（2）通过增加葡萄酒天然酒石酸盐保持能力的“加法”过程[4]。“减法”过程中的冷冻处理工艺是将葡萄酒的温度降至接近冰点，即零下-4～5 ℃，保持几天或1～2周的时间，然后保温过滤去除析出的KHT晶体，使葡萄酒达到冷稳定状态。因为冷冻法耗能、耗时[5]，近年离子交换法以及电渗析法也被开发出来，逐步投入生产中[6]。人们对于“加法”过程持续进行了研究：包括偏酒石酸（MTA）、甘露糖蛋白（MP）、羧甲基纤维素钠（CMC）[7-9]、以及天冬氨酸（KPA）等[10]。“加法”过程并非去除葡萄酒的KHT，而是利用添加剂对葡萄酒酒石酸盐的保持能力，抑制KHT沉淀。不同添加剂效果各有特点：偏酒石酸适合货架期短的产品，在通常储存条件下（10～18 ℃）的货架期为12～18个月[5]；甘露糖蛋白来自于酵母，系葡萄酒中天然存在的成分[11]；羧甲基纤维素钠在保证红葡萄酒色素稳定方面差强人意；聚天冬氨酸处理的葡萄酒电导率变化小，浊度显著降低，色度有改善，是一个发展方向[12-13]。“加法”过程可以避免传统冷冻法电能的消耗以及生产周期的延长，减轻对葡萄酒感官质量的不利影响，降低生产成本。但上述添加剂在国内还没有获得使用许可，需要科研及法规方面的工作来推动其在中国的应用。

葡萄酒生产者通过冷稳定测试来判断葡萄酒是否稳定，以指导生产。鉴于冷稳定是一个相对的概念，目前有几种常见的测试方法，但不同方法的置信度不同。孙建平等[14]比较了电导率法、饱和温度法，以及冷藏法，发现不同的测试方法判定标准不能统一。刘振来等[15]对电导率法和饱和温度法进行了验证分析。但全面阐述冷稳定测试方法还未见报道。本文比较5种冷稳定测试方法的原理、方法和适用范围，并介绍相关研究进展，以期为实际生产的工艺控制提供有益借鉴。

1 冷稳定测试方法

1.1 冷冻-融化法（Freeze-thawing Test）

原理：冷冻-融化法是根据KHT溶解度受温度影响的特性，直接采取降温促使酒石结晶析出的破坏性试验，并直接用视觉检查晶体是否形成的方法。该方法并非模拟成品酒的实际储存状态，结果只是对葡萄酒当前稳定性的定性预测。

方法：葡萄酒经过冷稳定处理后，在过滤之前，取样测试。样品无菌过滤后，注入玻璃管或试剂瓶中开始冷冻。需要注意的是取样后立即在低温下进行过滤，以避免酒样升温导致结果出现假阳性[16-17]。样品所需的冷冻时间取决于葡萄酒中的酒精含量。通常将葡萄酒放在冰箱中4～16 h不等，具体时长取决于产品酒精度含量及生产者对冷稳定程度的经验和要求[18]。

将样品从冰箱中取出，在室温下解冻。样品液化的同时，在强光下检查是否有晶体形成的迹象。如果出现晶体，则在达到室温后对样品进行重新检查，以确认晶体是否溶解。解冻后或室温下没有晶体，则表明葡萄酒冷稳定[16]。为方便观察，通常同时保留一个对照酒样用于比较。

酒样的无菌过滤采用的过滤膜孔径应与实际生产中使用的相一致，通常白葡萄酒采用的孔径尺寸为0.45 μm，红葡萄酒采用的为0.65 μm。

该方法的结论是定性的“通过”或“不通过”。“通过”是指无菌过滤的葡萄酒样品或经无菌过滤的成品葡萄酒在任何一次检查中都没有出现晶体；或者在第一次检查（融化）时发现晶体，但是在室温下晶体溶解（取决于酿酒师）。反之则为“不通过”。

可能出错的情况：冷冻时间不足；样品温度偏高；过滤不正确；没有在正确的时间观察样品；人工加热的样品；冰晶被误认为是酒石酸盐晶体。

适用范围：该法不需要复杂的仪器设备，降温设施用普通冰箱即可。因为操作简单，目前依然有很多酒厂采用。

在起泡葡萄酒和强化葡萄酒的生产中，因为酒精度变化幅度明显，影响到最终产品中酒石酸盐的溶解度，实验时需进行调整。起泡酒做冷冻-融化法测试时，需强化1%～1.5%的酒精，以模拟二次发酵后实际的酒精度含量[4]。

该方法适用于传统冷冻的“减法”过程，不适用于加法“过程”，比如以CMC处理的葡萄酒。

1.2 冷藏法（Refrigeration Test）

原理：冷藏法同样是基于KHT溶解度随温度变化的特性，降低样品温度至冰点附近进行测试。与冷冻-融化法的区别是，样品测试通常在不结冰的状态下进行，保持几天甚至几周的时间，以视觉观察是否有KHT晶体析出。葡萄酒的冰点计算公式如下：

冰点T ℃＝-（酒精度－1）/2

方法：具体取样与过滤操作同冷冻-融化法，但不使样品冻结。不同的酒厂采用的测试温度与保留时间参数有所不同：在0 ℃，保持1周；在-2 ℃，保持72 h；或者在-4 ℃，保持24 h等[18]。其中，将过滤后的葡萄酒样品置于冰浴锅内的冷冻（盐水）测试，-4 ℃保持3 d，然后检查晶体沉淀情况，也被称为“盐水”测试。有研究发现，这种“盐水”测试方法得出的结论与在酒窖条件下储存一年的葡萄酒的稳定性最接近，可以提供可靠的结果[19]。

适用范围：同冷冻-融化法一样，操作简单，不需要复杂设备，这是优点。但仅能得出定性的结果，如果结论是不通过，不能给出具体不稳定程度的参数。同样对最终酒精度有变化的样品，例如起泡葡萄酒，需采用强化酒精，以模拟最终产品酒精度。结果仅能说明葡萄酒的当前稳定性，而非长期稳定性[20]。

但该法比冷冻-融化法适用的范围要广，因为测试过程样品未达到冷冻状态，所以一部分“加法”过程的处理工艺也可以用。缺点是生产工艺处理需对测试结果等待时间较长。

1.3 电导率/微接触法（Conductivity Test/ Mini Contact Test）

原理：葡萄酒中的游离K+会因酒石的沉淀析出而损失，从而导致葡萄酒电导率发生变化。在一定的温度下，添加酒石“晶种”，使酒石酸氢钾过饱和而沉淀析出，再通过测定电导率变化，可预测葡萄酒的冷稳定性。微接触法最早被提出是利用称重法，通过确定增加酒石重量的多少来判定稳定性。因为操作复杂，逐步被改良。目前是通过检测电导率的变化来判定结果，与电导率法类似。但电导率法通常用电导率变化值的百分比来评价结果，而所谓的微接触法通常用具体的电导率变化数值来评价。

方法：测试需要的仪器包括电导率仪（量程100～1000 μS；）、0 ℃（±1.0 ℃）的恒温冰浴装置，及过滤装置等。

检测时，先开启搅拌，校准电导率仪（大约10 min）。将冷藏的葡萄酒样，立即进行无菌过滤并脱气，然后置于0 ℃（±1.0 ℃）的冷浴中。测试过程中持续搅拌，保持样品温度恒定。将电导率探头插入样品中，并在达到测试温度时读取电导率（C1）。将KHT粉末加入到冷却的样品中，并搅拌几分钟。当葡萄酒的电导率值稳定时，记录电导率读数（C2）。初始读数（C1）和添加后读数（C2）的电导率变化比率将指示所测样品的稳定性水平。

注意事项：在测试温度下，电导率值不稳定且持续降低，说明所测样品不稳定；电导率达到并保持稳定值的样品是稳定的。测试结论仅适用于测试温度或以上，如果葡萄酒储存温度低于测试温度，则仍有可能不稳定，故测试应该在尽可能低的温度下进行。有测试方法选择白葡萄酒在0 ℃下进行测试，红葡萄酒在5 ℃下进行测试，KHT的粒度应在40～70 μm[18]。

可能出错的情况：样品温度不准确、仪表或探头故障、无法搅拌样品、计时和仪表读数不正确、没添加KHT、过滤操作不当、样品过滤温度不适合。

结果判定：

（1）电导率法判定标准，采用的计算公式如下：

电导率的变化△λ小于3%～5%，则表示葡萄酒稳定[16, 21]。

（2）微接触法判定标准，采用的计算公式为：

不同的研究者设定的略有差别。例如GUISE采用的微接触测试判定标准为：如果电导率的变化值△λ＜30μs/cm，则非常稳定；△λ变化值介于30～50μs/cm为稳定；△λ变化值介于50～70μs/cm为警告；△λ＞70μs/cm则为不稳定[22]。

适用范围：该法检测用时短，属定量分析。可用于直接冷冻、电渗析、以及外源添加KPA、CMC等的冷稳定测试，适用范围广泛。

1.4 饱和温度法（Saturation Temperature，Ts）

原理：葡萄酒的饱和温度（Ts）是指可以溶解KHT的最低温度，亦即溶质（KHT）在溶液（葡萄酒）里达到饱和状态时的温度[1]。在一定的范围内，超过或低于这个温度将会使溶液由饱和状态变为不饱和状态或者由不饱和状态变为饱和状态，使溶液中的溶质晶体溶解或析出。Ts值越低，葡萄酒就越稳定；Ts值越高，KHT沉淀就越容易发生。VALLEE提出了饱和温度法来判断葡萄酒的酒石稳定性[23]。

饱和温度法即通过测定葡萄酒的饱和温度Ts，与既定的“Ts判定标准”比对来判定稳定性的检测方法。“Ts判定标准”理论上为葡萄酒在正常储存条件下不出现酒石酸盐沉淀的饱和温度上限值。

方法：测试需要的仪器包括电导率仪（量程为100～1000μs）、控温及样品搅拌装置。控温单元用来调节样品温度，保证检测过程中实现先是对样品降温，随后将酒样以稳定的速度升温的过程。

白葡萄酒：在电导率仪中把葡萄酒温度降到5 ℃，然后逐渐升温到25 ℃，在升温过程中，按既定的温差记录温度和电导率。同样条件需要做两个样品，一个对照样品，一个加4 g/L KHT的酒样，将两个酒样的结果在同一坐标系中，绘制成温度-电导率曲线图，得到饱和温度曲线，两条曲线明显分开时的交点就是样品的饱和温度Ts[23-25]；升温速度应该稳定，DOS SANTOS选择的升温速度为0.5 ℃/min[24]。曲线绘制参照图1。

红葡萄酒：初始温度降到10 ℃，升温至30 ℃，其它操作同白葡萄酒。

对白葡萄酒的Ts判定是10 ℃，即Ts＜10 ℃时为稳定， Ts＞10 ℃时不稳定；对红葡萄酒的Ts判定是16 ℃，即Ts＜16 ℃时稳定，Ts＞16 ℃时不稳定。

适用范围：适用于包括电渗析处理[26]的大多数冷稳定处理的测试，但对于利口酒（雪利酒）应用受限[22]。研究结果表明，结晶抑制剂不会影响盐的溶解，Ts值不会因陈酿过程中发生的变化而改变[4]，因此饱和温度法Ts预测的是葡萄酒长期稳定性。

1.5 离子浓度积法（Concentration product，CP）

原理：基于根据溶解度可预测溶质沉淀的原理，根据葡萄酒中KHT的K+和HT-的离子浓度积来预测冷稳定，即离子浓度积法。KHT的离子浓度与酒石酸在葡萄酒中的电离平衡直接相关，而电离平衡主要受pH、酒精影响。 BERG以模拟酒试验在不同pH、酒精度的条件，HT-在H2T中的占比，制定了HT-（%）与pH、酒精度的关系表。在此基础上，通过检测样品K+、总酒石酸H2T的含量，以及酒精度与pH，即可计算出离子浓度积CP数据，与表1的推荐数据对比即可预测酒石稳定性[27]。

方法：检测葡萄酒样中K+、H2T、pH和酒精度，以后3项的数据得出HT-数值，从而计算出葡萄酒中的离子浓度积CP。

CP的计算公式如下：

其中：K+、H2T单位为g/L；HT-(%)值为百分数，系查表得出（表略）。

结果判定：与表1中数值比较，如果相应样品CP值高于建议数值，则说明葡萄酒酒石不稳定。

适用范围：CP法测试需要用到原子吸收或火焰光度仪检测钾离子浓度，对一般酒厂来说仪器配置与检测人员的要求偏高。CP法仅是对酒石酸盐离子检测，不能同时评估蛋白、单宁等保护胶体对冷稳定的影响，测试结果置信度偏低。综上，CP法目前在实际生产中的使用比较少。

2 讨论与进展

葡萄酒冷稳定虽然主要与KHT有关，但也受其它大分子胶体成分影响。目前冷稳定测试方法各有特点，科研人员针对测试方法的局限性与不足，开展了相关的研究，部分研究进展介绍如下：

Gomez Benitez等[28]依据雪利酒的酒石酸氢钾中的饱和度更高的现象，对比了饱和温度（Ts）法和微接触法的结果，发现微接触法可作为一种快速、可靠地确定雪利酒酒石酸稳定性的方法。

Henriques等[29]开发了受控的冷冻-融化测试法，以获得电渗析处理葡萄酒所需的去离子度（Deionization degree，DD）参数，所得结果具有重现性，可用于指导生产。具体方法是将样品在-20 ℃下冷冻并控制结晶核，保温24 h，随后在0 ℃解冻。去离子度是通过测定葡萄酒在0 ℃时的初始和最终电导率确定。

表1 不同葡萄酒在0 ℃冷稳定最高CP限值Table 1 Maximum CP limit of cold stability of different wines

Bosso等[30]研发了一种改良微接触测试方法。该方法是在测试酒样中添加过量KHT（10 g/L），保持0 ℃的恒温状态下，搅拌4 min，测试葡萄酒的电导率（△λ）下降。并定义了明确的测试操作条件，添加的KHT晶体类型和剂量，从而降低了检测成本，大幅缩短了检测时间，简化了测试管理。通过比较微型接触测试和冷冻测试的结果，定义了阈值稳定性值：白葡萄酒的△λ＜5%，红葡萄酒和桃红葡萄酒的△λ＜4%；对于特别富含多酚类化合物的红酒，△λ＜3%。

饱和温度法的“Ts判定标准”没有一个统一的数值，这是因为KHT的亚稳性和晶体生长抑制剂的存在，Ts值与实际稳定温度不符，且存在一定程度的差异[25]。王树生等[31]以国产葡萄酒为试验对象，对“Ts判定标准”进行了验证，得出白葡萄酒Ts是10 ℃，红葡萄酒的Ts是16 ℃，推荐该标准可用于指导生产的结论。Lambri等[3]研究了模拟酒中蛋白质与单宁的含量发现，随着蛋白质单宁比的降低，酒石酸盐的保留能力增加。单宁浓度的增加使饱和温度Ts值降低，从而使过饱和度范围变窄，而仅蛋白质的存在增加了过饱和度的范围，使Ts值增加。Berta[32]给出了“Ts判定标准”范围，白葡萄酒在5～12.5 ℃，红葡萄酒在10～21.1 ℃，即Ts低于此范围是稳定的。吕振荣等[33]试验表明，红葡萄酒Ts低于15 ℃、白葡萄酒Ts低于12 ℃是稳定的。葡萄酒生产者需根据自己葡萄酒的特点来确定“Ts判定标准”。

葡萄酒酒石的稳定性受大分子胶体等多种成分与因素的影响，一种测试方法常常不能满足生产对于准确性的要求，一些复合方法被开发出来：刘振来等[15]经试验确定其选用的电导率法与饱和温度法复合指标来预测葡萄酒的冷稳定：（1）电导率差△λ＜25μS/cm；（2）饱和温度Ts：白葡萄酒Ts＜10.5 ℃时稳定，Ts＞10.5 ℃时不稳定；红葡萄酒Ts＜20 ℃时稳定，Ts＞20 ℃时不稳定；（3）饱和温度曲线走向：饱和温度的二条曲线在相交之前应该结合紧密或稍有分离，如果分离过大则有沉淀危险。当同时符合以上3个条件时，说明葡萄酒酒石稳定，如有一条不符，则有酒石沉淀危险。

澳大利亚葡萄酒研究所AWRI建议通过在- 4 ℃下保持3 d的冷藏（盐水）测试和Ts测试相结合，可获得有关酒石稳定性的最可靠信息，因这两种测试相结合可得出葡萄酒的当前稳定性及其潜在的长期稳定性[34]。