葡萄皮尔斯病的研究进展

时间：2024-05-25

杨桂兰，昝林生，赵艳侠，亓桂梅*

（1. 山东省葡萄研究院/农业农村部华东都市农业重点实验室/山东省葡萄栽培与精深加工工程技术研究中心，济南 250100；2. 德州学院，德州 253001）

皮尔斯病（Pierce's disease，PD）是一种严重的细菌性病害，由细菌学家Pierce于1892年首次在葡萄上发现，因此加州食品农业部将其命名为皮尔斯病。该病主要发生在美国的加州和东南部地区，在墨西哥、中南美洲的一些国家，以及法国、新西兰也有发生。2002年，我国台湾有发现皮尔斯病的报道[1]。

1978年，Davis等[2]从葡萄中分离出致病菌。1987年，Wells等[3]对其进行分类，命名为木质部难养菌(Xylella fastidiosa)。木质部难养菌是严格的需氧菌，属于变形菌门（Proteobacteria）、黄色单胞菌目（Xanthomonadales）、黄单胞菌科（Xanthomonadaceae）、木杆菌属（Xylella），是一种革兰氏阴性细菌，生长缓慢，杆状，大小为0.25～0.35μm×0.9～3.5μm，无鞭毛，通过Ⅳ型菌毛运动。木质部难养菌包括许多亚种：X. fastidiosasubsp.fastidiosa（Xff）；X. fastidiosasubsp.Sandyi（Xfs）；X. fastidiosasubsp.pauca（Xfp）；X. fastidiosasubsp.multiplex（Xfm）；X. fastidiosasubsp.Tashke和X.fastidiosasubsp.morus，其中，Xff是葡萄皮尔斯病的致病菌。除此之外，可能还有别的亚种存在，但目前还没有发现。

许多吸食植物汁液的昆虫，比如叶蝉、沫蝉等都是木质部难养菌的载体。当它们从感染了皮尔斯病的植株中摄食时，木质部难养菌就会粘附在其口器上，然后在其前肠中生存和繁殖[4-6]，并随着昆虫的取食而传播到其他植株上。感病植株表现叶缘干枯、变黄，叶片最终脱落，通常会在1～5年内死亡，给葡萄和葡萄酒产业带来巨大的损失。自从皮尔斯病被发现以来，仅在加州就有28个县有该病发生。据报道，1994—2000年，该病摧毁了加州北部超过400 hm2的葡萄园，加州南部地区每年损失约3790万美元。

韩阳阳等[7]基于Maxent模型对葡萄皮尔斯病在中国的适生性分析认为，我国的黄淮海地区和长江中下游地区是皮尔斯病的潜在分布区，因此，对该病的研究和防范不能掉以轻心。目前，包括我国在内的世界许多国家，已经将皮尔斯病列为检疫性病害，并且制定相应的检疫法规和检疫措施。为了更好地掌握皮尔斯病的发病情况，进行有效预防，本文对皮尔斯病的研究现状进行综述，旨在为葡萄皮尔斯病的检测、防治和后续研究提供参考。

1 葡萄皮尔斯病的症状和发病机理

1.1 症状

葡萄皮尔斯病的症状随着感病葡萄品种的特点以及感病时间和季节因素而变化。与当季感病植株相比，上一季感病植株通常会表现出更严重的症状。

起初，感病植株叶缘突然干枯、变黄（红色品种中会出现一条红色带）[8-9]。随后，焦枯的叶片掉落，通常从叶柄的远端开始脱落，留下叶柄附着在枝条上[10]。感病严重的植株在夏末叶片就全部脱落。在感病第一年，症状局限在一个或几个枝条，但随着时间的推移，范围逐渐扩大。感病组织中的细菌浓度随着季节的变化而变化，春末夏初达到最大值。通常在感病的前4周，在新芽中检测不到木质部难养菌，但能在成熟组织中检测到[9]。感病枝条呈现绿色和褐色相间[10]，枝条的顶端最终枯死，新长出的枝条短、矮化。此外，葡萄产量逐步减少，大多数果穗干枯。感病植株通常在1～5年内死亡[11]。

1.2 感病植株的生理变化

研究发现，皮尔斯病感病植株比正常植株生长势减弱，新梢数量减少。清晨，正常叶片和感病叶片的气孔张力没有显著区别，随后感病叶片的气孔张力迅速上升，而正常叶片的气孔张力相对不变。感病叶片的蒸腾作用和光合作用受到抑制，脱落酸、葡萄糖、果糖、钙离子和镁离子浓度升高，钾离子浓度降低。感病叶片失绿组织中的葡萄糖和淀粉的浓度低于绿色组织或者正常叶片。感病叶片中叶绿素含量降低与电解质渗出率、脂类过氧化和氧自由基的增加有关[12-13]。

1.3 感病植株木质部的形态学变化

木质部难养菌侵入宿主植物的木质部中，IV型菌毛使其沿着木质部上下移动。它们在木质部中大量繁殖，形成聚合物。感病植株的木质部中形成果胶凝胶（Pectin Gels）和侵填体（Tylose），从而阻止了病菌传播，使某些葡萄品种具有对皮尔斯病的耐受性，但是也阻止感染部位的水分运输[14]。

1.4 感病机理

起初科学家们认为，皮尔斯病症状是由于病菌形成的聚合物以及病菌诱导产生的果胶凝胶和侵填体阻塞导管，导致水分亏缺引起的[15-16]。这就意味着症状的严重程度与病菌浓度成正相关。但事实上，它们之间的关系非常复杂。首先，Thorne等[11]发现，皮尔斯病的症状与水分亏缺的症状并不相同；其次，许多研究表明，被Xff和果胶凝胶阻塞的导管只占很小的比例[8,17]；另外，Gambetta等[18]发现，皮尔斯病症状的严重程度与Xff浓度的关系非常小。Xff无规律地分布在整个叶片中，有明显木质部阻塞的叶片中Xff浓度可能会很低。皮尔斯病机理的另外一种假说是，感病叶片产生大量的乙醇，诱导木质部产生果胶凝胶和侵填体，皮尔斯病症状是植株对于果胶凝胶和侵填体的出现而产生的系统反应的结果。植物毒素和细胞程序性死亡也被认为参与皮尔斯病症状的诱导。

2 葡萄皮尔斯病检测和鉴定方法

2.1 显微鉴定

在感染的早期阶段，及时、准确地检测出病原菌，对于阻止病原菌进一步传播非常重要。但是木质部难养菌的检测和鉴定并不容易。因为该病菌生长缓慢，通常需要2—3周的时间才能在琼脂培养基上得到菌落；其次，许多常用培养基不适合该病菌的生长，需要采用选择性培养基（PD2、PW、CS20) 进行培养[19]。木质部难养菌细胞很小，只能使用暗视野、相差显微镜[3]进行直接鉴定。

2.2 免疫方法检测

免疫方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫荧光技术也可以用来检测木质部难养菌。Buzkan等[20]采用免疫荧光技术分别从接种3周的抗性葡萄品种‘F8909-08’和易感葡萄品种‘霞多丽’中检测到木质部难养菌。但是要想在感染早期准确、快速地检测出病原菌，经典的免疫方法就不够灵敏了。而且，大多数免疫方法仅在物种水平有效。

2.3 分子检测技术

2.3.1 特异引物PCR

感病植株中的木质部难养菌可以用特异引物PCR来检测。1994年，Firrao等[21-22]通过PCR扩增16S rDNA和细菌DNA上未知功能的片段检测该病菌。随后，越来越多的特异引物被设计出来，其中16S rDNA和16S-23S的间隔子是使用最频繁的目的基因[23-24]。由于细菌基因组的一些变异，尤其是引物识别位点的突变，使PCR检测容易出现假阴性。Livingston等[25]采用gyrB和一套看家基因的引物进行检测，弥补了用单个基因引物容易出现假阴性的缺陷。

通过设计特异PCR引物，能够检测木质部难养菌的不同种、亚种甚至同一亚种的不同菌株。2006年Hernandez等[26]用3个目的基因的多对引物组合来区分感染葡萄、巴旦木和夹竹桃的木质部难养菌。通过这种方法，不同亚种的木质部难养菌能被区分开来，甚至multiplex亚种的ALSI和ALSII两个菌株也能被区分开来。

2.3.2 实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）

RT-PCR同特异引物PCR一样，具有很高的灵敏度和特异性，但是扩增产物要短一些，而且需要用荧光染料（SYBR green 或TaqMan）标记探针。RT-PCR能够研究木质部难养菌在感病植株中的时空分布。通过RT-PCR可以检测出不同时间、不同植物组织中的病菌量，将其与症状相结合，就能找出不同抗性植株之间的差别。2002年，Schaad等[27]直接用葡萄枝条次生木质部的汁液，不用提取DNA就能进行RT-PCR，并且能够从无症状的植株中检测到木质部难养菌，其检出率为26%。

2.3.3 限制片段长度多态性（RFLP）和随机扩增的多态性DNA（RAPD）

19世纪80年代末90年代初，人们开始采用RFLP和RAPD技术研究木质部难养菌菌株间的差异和致病性。1992年，Chen等[28]用RFLP技术从8种不同的宿主中鉴定出24个木质部难养菌菌株。2006年，Picchi等[29]用RFLP技术从柑橘、葡萄等6种宿主中鉴定出43个不同的木质部难养菌菌株。RAPD技术操作简单、快速，不需要复杂的设备和测序，在常规分析中使用广泛，但不易区分关系比较近的菌株。例如，Chen等[30]比较来自柑橘、葡萄和桑树的3个木质部难养菌菌株群体的RAPD和16S rDNA序列，并分别绘制系统树。采用RAPD技术得到的系统树中，来自佛罗里达州、内布拉斯加州和巴西的一共21个木质部难养菌菌株被分为3个不同的群体，分别导致皮尔斯病、柑橘杂色褪绿病和桑树叶焦病。而通过16S rDNA技术得到的系统树只能区分出导致皮尔斯病和柑橘杂色褪绿病的两个群体，导致桑树叶焦病的群体被包含在导致皮尔斯病的群体中。

2.3.4 简单重复序列（SSR）

SSR是用来研究不同菌株遗传变异性的技术。SSR由于串联重复序列数量的多变性，使其在不同细菌菌株中具有很高的多态性，是分子研究的一个有效工具。该技术操作简单，花费较少；DNA需要量相对较少，是共显性标记，可重复性好。2013年，Lin等[31]采用SSR技术对来自加利福尼亚州和得克萨斯州14个郡的Xff种群进行结构和多样性的遗传变异分析。结果显示，从两个州不同葡萄栽培地点分离到的Xff种群都具有高度的遗传多样性，得克萨斯州Xff种群的遗传多样性（0.835）高于加利福尼亚州（0.662）。

2.3.5 单核苷酸多态性（SNP）

木质部难养菌是首次完成全基因组测序的植物病原菌[32]。随着越来越多的木质部难养菌菌株的基因组序列的测序，SNP技术逐渐成为一种从分子水平研究该病原菌的有效方法。2006年，Doddapaneni等[33]采用SNP标记分析分别来自葡萄、柑橘、夹竹桃和巴旦杏的4个木质部难养菌菌株的基因组序列的变异。2015年，Montes等[34]采用SNP标记技术评估来自柑橘和咖啡的木质部难养菌菌株的遗传多样性。

2.3.6 多位点序列分型（MLST）

MLST技术是20世纪末研发出的一种新的鉴定病原菌的技术。通过分析一小部分（通常7个）看家基因核苷酸序列的差异来研究不同菌株的特征。MLST技术具有很高的分辨率，既适于分子流行病学研究，也可用于分子进化学研究。它的优点是操作简单、快速、可重复性好。2005年，Schuenzel等[35]采用MLST方法对来自葡萄、夹竹桃、橡树、桃树、李树和柑橘中的26个木质部难养菌样本的进化关系、地理差异和分歧时间进行分析。2010年，Yuan等[36]采用改良的MLST技术，对Xff和Xfs两个亚种进行遗传多样性分析。尽管SSR和MLST技术的研究结果相似，但是SSR适合在种群水平研究木质部难养菌，而MLST更适合对亚种和菌株进行研究。

3 葡萄皮尔斯病的防治措施

3.1 加强检疫

对于引进的葡萄种苗以及其他木质部难养菌的宿主植物加强检疫，防止皮尔斯病在新地区的引入和传播。

3.2 加强栽培管理

在感病的初期，及时检测和识别，将感病的枝条去除，或者整株移除，对皮尔斯病的控制非常重要。清除葡萄园里的杂草和附近木质部难养菌的其他宿主植物，也是一种主要的预防策略，可以减少皮尔斯病的发生。其他栽培管理措施，如定期耕地和除草，可以抑制昆虫载体幼虫的生长[37]。Krugner等[38]提出，玻璃翅叶蝉是一种传播皮尔斯病的主要害虫，它倾向于花费较少的时间去吸取木质部汁液，所以通常会略过缺水植物。因此缺水灌溉可以有效减少皮尔斯病的发生。

3.3 用杀虫剂杀死昆虫载体

主要是采用一些传统的杀虫剂，比如吡虫啉。据报道，杀虫剂的使用对于加州皮尔斯病的控制非常关键，加州特美谷（Temecula）整个区域喷洒杀虫剂能够使葡萄产量在一定程度上恢复。Daugherty等[39]研究发现，葡萄园里使用杀虫剂能够减少皮尔斯病，但是要在几个生长季后才能看出效果。然而，长期使用杀虫剂，不但对环境造成很大的污染，给其他的生物带来负面影响，还会使昆虫产生抗药性。

3.4 热汤处理（Hot Water Treatment，HWT )

将休眠的葡萄枝条用50 ℃的水浸泡45 min，可以清除Xff的感染[40]。

3.5 选育抗性品种

在美国东南部和墨西哥北部发现具有不同程度皮尔斯病抗性的野生葡萄种群。将野生葡萄品种中的皮尔斯病抗性基因引入到一些重要葡萄品种中的工作已经开展，并卓有成效。2005年，Krivanek等[41]证实沙地葡萄（Vitis rupestris）和峡谷葡萄（Vitis arizonica）的杂交种具有皮尔斯病抗性，并且抗性可以遗传。

加州大学戴维斯分校（UCD）的葡萄栽培学教授兼育种专家Walker等在加州食品农业部的PD/GWSS董事会基金的支持下，已经培育出5个抗皮尔斯病的新品种。这5个品种在温室和田间试验中都表现出很强的抗性，并且具有很高的品质。2019年11月5日，Walker对这5个品种向美国专利及商标局提出专利申请。这些品种有望在皮尔斯病流行的地区进行种植。

3.6 应用抗性砧木

运用抗性砧木可以增强葡萄栽培品种对皮尔斯病的抗性，但是机理还不明确。据推测，砧木产生的某些物质能够通过木质部汁液转移到接穗，可能会影响木质部难养菌的生长；砧木也可能通过影响接穗的活力和营养物质的吸收来提高其对病原菌的抵抗能力[42-43]；另外，抗性砧木还能降低木质部难养菌从最初的感染位点向延长枝转移的能力，从而限制了感病接穗中皮尔斯病的进一步发展。

3.6.1 应用野生型抗性砧木

木质部难养菌起源于墨西哥北部和美国东南部。在这些地方，野生葡萄品种具有皮尔斯病抗性，即使被木质部难养菌感染，也不会表现出症状。然而，这些野生葡萄品种的果实品质不尽人意，比如口感差、浆果大小以及生长习性等具有缺陷。

2013年，Wallis等[44]研究发现，‘赤霞珠’分别嫁接到‘101-14MG’‘1103P’‘420A’或者‘Schwarzmann’砧木的皮尔斯病症状比分别嫁接到‘110R’ ‘5BB’或‘SO4’砧木的要轻。‘霞多丽’分别嫁接到‘盐河’（Salt Creek）或‘自由’（Freedom）砧木的皮尔斯病症状要比分别嫁接‘RS3’或 ‘Schwarzmann’砧木的轻。使用特定的砧木，即使只能使栽培种的皮尔斯病抗性略有提高，也可以显著降低皮尔斯病造成的长期损失。

3.6.2 应用皮尔斯病抗性转基因砧木

随着遗传转化技术的出现，采用生物技术提高易感品种对皮尔斯病抗性的研究越来越多。Lindow等[45]发现，一个表达木质部难养菌DSF合成酶的转基因砧木能够使接穗表现出较少的皮尔斯病症状，而且能够减少病菌在植物体内的移动。另外，在温室中CAP（Chimeric Antimicrobial Protein）或PGIP（Plant Polygalacturonase Inhibitory Protein）转基因砧木能使接穗中病菌浓度降低，表现出很少的皮尔斯病症状[46]。一种表达溶菌抗菌肽（Cercoprin B）和木质部难养菌外膜蛋白（MopB）的融合蛋白的转基因砧木，也使接穗表现出较少的皮尔斯病症状[47]。

近年来，对于皮尔斯病防治措施的研究越来越多。由于杀虫剂的使用容易使昆虫产生抗药性，因此许多替代办法应运而生，比如Surroundr WP、超敏蛋白（Harpin）和物理屏障（Screen Barrier）[48-50]。另外，还可以通过一些载体共生菌分泌的物质抑制Xff的传播[51]；用抗生素和抗菌肽杀死病菌[52]；利用植物内生菌PsJN减轻皮尔斯病症状[53]；利用病毒和真菌抑制载体种群的扩大等[54-55]。