不同架式下‘桂葡6号’葡萄果皮中黄烷-3-醇组分分析

谢林君，张劲，周咏梅，谢太理，黄小云，成果*

（广西壮族自治区农业科学院葡萄与葡萄酒研究所，广西南宁 530007）

黄烷-3-醇类物质存在于很多植物的果实、叶片、果皮和种子中，可以使植物免受微生物、昆虫和食草动物的伤害[1]。葡萄的黄烷醇类物质则主要分布在果皮、籽、果梗中[2-4]，有单体的形式及聚合体的形式，单体主要是表棓儿茶素[(-)-epigallocatechin，EGC]、儿茶素[(+)-catechin，C]、表儿茶素[(-)-epicatechin，EC]和表儿茶素没食子酸酯[(-)-epicatechin-gallate，ECG][5-6]。此外，黄烷醇类物质构成葡萄酒的基本骨架，是葡萄酒中重要的苦味及涩味物质；由于其易于被氧化，可以与花色苷发生反应生成稳定的复合产物，从而可以防止葡萄酒色素被氧化，保护葡萄酒颜色[7-8]。黄烷-3-醇类物质的组成和含量随着果实的发育或者生长环境的变化而有所不同；当果实成熟度增加时，黄烷-3-醇类物质的聚合体（原花色素）含量及聚合度也逐渐增加[9-10]。

影响葡萄黄烷醇合成积累差异的因素主要包括内在因素和外在因素[11-12]。葡萄本身的遗传特性构成其内在差异因素，黄烷醇含量和组成随着不同葡萄品种而改变。环境因素是主要的外在因素，包括光照、温度、降雨、栽培架式等。栽培架式的改变，则会形成不同的树体结构，从而影响到植株的光合速率及生命活动[13]。不同的架式，既影响果实发育及最终产量，也影响果实组分，已有大量文献对此报道[12]。选择合适的葡萄架式，可以提高葡萄后期整体产量及果实品质[14-15]，还促进果实中风味物质的积累，酿出感官品质好的葡萄酒[16]。

‘桂葡6号’葡萄是广西壮族自治区农业科学院葡萄与葡萄酒研究所选育的优良酿酒品种[17]。目前国内外关于栽培架式对酿酒葡萄黄烷-3-醇类影响的研究主要集中于欧亚种，本研究团队前期进行‘桂葡6号’果实黄烷-3-醇类组分特征影响的相关研究[18]，但关于不同栽培架式对‘桂葡6号’葡萄果皮中黄烷-3-醇类影响的研究尚未开展。本研究应用HPLC测定不同架式‘桂葡6号’葡萄果实发育过程中果皮中黄烷-3-醇成分及其含量的变化，为实际生产中通过栽培措施改良葡萄品质提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验地点与材料

试验区‘桂葡6号’葡萄于2010年3月种植，果园土质为黄壤土，株行距1.6 m×3.0 m，“V”形篱架栽培，树势中等，管理水平良好，田间土肥水管理和病虫害防治等同常规。根据新梢和垂直立柱的夹角不同共设3个处理，0°单臂篱架；30°“V”形篱架；60°“V”形篱架。每种架式选择树体长势基本一致的21株作为实验树，每7株合并作为一个生物学重复。

1.2 样品采集与理化指标测定

样品于花后4周（2017年9月28日）开始，每两周采样一次至采收期结束。每个处理采样300粒，包含3个生物学重复（每个重复100粒），这些果粒来自于果穗的各部位，并立即用冰盒保存。其中150粒样品（每个生物学重复50粒）用于测定果实鲜重、单粒果皮鲜重、可溶性固形物和可滴定酸含量。具体步骤为先将果实称重，破碎取汁，分离果皮，吸水纸吸去多余水分后称量果皮鲜重。其他样品于-80 ℃冷冻备用。

可溶性固形物采用PAL-1型手持折射计（Atago,Tokyo, Japan）测定。可滴定酸用酸碱滴定法测定，结果以酒石酸表示。全部测定重复3次。

1.3 黄烷-3-醇类物质的检测

黄烷-3-醇采取间苯三酚裂解法提取参照Liang等[19]的方法：取0.1 g葡萄皮干粉于10 mL离心管中，加入1 mL间苯三酚缓冲液和0.005 g抗坏血酸，于50 ℃下静置裂解20 min，再加入1 mL乙酸钠停止反应，离心15 min，取上清液于10 mL离心管中；重复3次，合并上清液摇匀，于-80 ℃冷冻备用。

检测方法应用岛津LC-20AD高效液相色谱参考成果等[18]方法对提取产物进行检测。流动相A：0.2%乙酸水溶液。流动相B：乙腈∶0.2%乙酸水溶液=4∶1。流速：1.0 mL/min。柱温：25 ℃；检测波长：280 nm；进样量：25 μL。

1.4 葡萄果皮中黄烷-3-醇类物质的定性与定量

通过表棓儿茶素、儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯标准品的保留时间对黄烷-3-醇进行定性，应用外标法，绘制这4种标准品的标准曲线进行定量。相关系数在0.97以上，结果以mg/kg表示。

1.5 试剂与标样

标准品表棓儿茶素、儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯均为色谱级，购于Sigma（St. Louis, MO,USA）公司，纯度为98%以上。色谱纯乙腈、甲醇和乙酸均购于Fisher（Fairlawn, NJ, USA）公司，纯度达99.9%以上；其余试剂均为分析纯试剂。

1.6 数据处理

数据处理采用SPSS 20.0（SPSS Inc., Chicago, IL,USA）进行显著性分析。绘图采用Microsoft Excel 2010。

2 结果与分析

2.1 不同架式下‘桂葡6号’葡萄果实发育期理化指标变化情况

由图1可以看出，3种架式下‘桂葡6号’葡萄果实发育期的粒质量、可溶性固形物和可滴定酸含量分别在各处理果实中的变化趋势一致。葡萄粒质量随着果实的发育逐渐上升，至10周后，增长趋势减缓且变化不明显（图1A）。在12周时，单臂篱架处理和30°“V”形架处理粒质量显著高于60°“V”形架，单臂篱架和30°“V”形架之间则无显著性差异。如图1B，果皮鲜重呈不断上升的趋势，在花后6周时，60°“V”形篱架的果皮鲜重显著高于其它两个架式。随着果实发育期的变化，3个处理间的果皮鲜重差异不显著，至采收时，单臂篱架的果皮鲜重最高，30°“V”形架次之，60°“V”形架的最低。图1C所示，3个架式下的‘桂葡6号’葡萄的可溶性固形物含量在花后均呈现先慢后快的增长趋势，在花后10周时，30°“V”形架、60°“V”形架显著高于单臂篱架，但是在12周时，3个处理间差异不显著。由图1D可以看出，3种架式下‘桂葡6号’葡萄的可滴定酸含量则是呈现先上升后下降的趋势，在花后10周时达最大值，此时，30°“V”形架和60°“V”形架的滴定酸含量显著高于单臂篱架；至花后12周时，30°“V”形架中的滴定酸含量显著高于其他两个架式，而单臂篱架和60°“V”形架之间无显著差异。

2.2 不同架式下‘桂葡6号’葡萄果实发育期果皮中黄烷醇总量及4种单体变化趋势分析

由图2A所示，不同架式下‘桂葡6号’葡萄果实发育期果皮中黄烷-3-醇总量变化趋势基本一致，均呈先下降后上升的趋势。在花后8周时，30°“V”形架果皮中黄烷-3-醇含量降至最低点，后缓慢上升。60°“V”形架则是在花后10周降至最低点，后缓慢上升。单臂篱架在花后8周时降至最低，至10周时，保持平稳；至12周时，缓慢上升。3个处理在花后8周至10周两两间均呈显著差异。至花后12周，单臂篱架和30°“V”形架无显著差异，且显著高于60°“V”形架。在4种单体含量中，表棓儿茶素含量最高，表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯次之，儿茶素含量最低。如图2B，在整个发育期中，果皮中表棓儿茶素含量与黄烷-3-醇总量变化趋势一致，呈先下降后上升的趋势；在花后10周时，3个处理间差异显著，30°“V”形架表棓儿茶素含量最高，单臂篱架次之，60°“V”形架中的最低；而30°处理的最低点在花后8周，此时30°“V”形架处理的果皮中表棓儿茶素含量显著低于60°“V”形架处理。待到花后12周时，单臂篱架处理和30°“V”形架处理无显著差异，它们与60°“V”形架处理之间存在显著差异。由图2C可知，3个处理中果皮的儿茶素含量呈波动变化趋势，单臂篱架处理呈波动上升的趋势，30°“V”形架处理和60°“V”形架处理则呈先下降后上升趋势。在花后12周时，单臂篱架处理和30°“V”形架处理之间无显著性差异，且它们显著高于60°“V”形架处理。图2D所示，3种架式下的‘桂葡6号’葡萄皮中的表儿茶素含量先急速下降后缓慢上升，至花后12周时，0°处理其含量显著高于30°“V”形架处理和60°“V”形架处理，后两者间无显著差异。由图2E可知，表儿茶素没食子酸酯的含量变化趋势亦是先下降后略有上升，至花后12周时，3个处理之间存在显著性差异，其中，30°“V”形架处理中含量最高，60°“V”形架处理次之，单臂篱架处理含量最低。

2.3 不同架式下‘桂葡6号’葡萄果皮中各组分占总量比例差异分析

如图3所示，表棓儿茶素含量占黄烷-3-醇总量99%以上，其它3种单量之和占1%。3种架式下的‘桂葡6号’葡萄果皮中表棓儿茶素比例变化趋势基本一致，花后10周和12周3个处理的表棓儿茶素比例无显著差异。单臂篱架处理和30°“V”形架处理中儿茶素在花后10周达峰值，60°“V”形架处理则是在花后8周达峰值；3种架式下的儿茶素比例整体呈现先快速上升后趋稳的趋势。表儿茶素比例则是随着果实发育逐渐降低，至采收时略有回升，单臂篱架处理中的表儿茶素比例显著高于30°“V”形架处理，60°“V”形架处理则与它们无显著差异。表儿茶素没食子酸酯在花后6周达峰值，之后呈下降趋势，待采收期略有回升，单臂篱架处理显著低于30°“V”形架处理和60°“V”形架处理。采收期时，30°“V”形架处理和60°“V”形架处理的表儿茶素没食子酸酯显著高于单臂篱架处理。

2.4 不同架式下‘桂葡6号’葡萄果皮中3',5'-羟基和3'-羟基取代黄烷-3-醇比例

将黄烷-3-醇按其B环羟基化程度不同分类，可分为3',5'-羟基化和3'-羟基化两种。本研究结果表明，3种架式下的‘桂葡6号’葡萄果皮中所含有的黄烷-3-醇以3',5'-羟基化修饰为主，且3',5'-羟基化黄烷-3-醇比例随发育期呈波动上升趋势，而3'-羟基化黄烷-3-醇比例持续降低。花后6周时，3种架式下的‘桂葡6号’葡萄果皮中3',5'-羟基化黄烷-3-醇存在显著差异，单臂篱架处理的含量最高，30°“V”形架处理次之，60°“V”形架处理最低。随后，这种差异逐渐缩小，至花后10周时，3个处理间无显著差异。而3种架式下的‘桂葡6号’葡萄果皮中所含有的3'-羟基化黄烷-3-醇在花后6周时达最大值，其中，单臂篱架处理的3'-羟基化黄烷-3-醇含量最低，30°“V”形架处理次之，60°“V”形架处理的含量最高。至花后8周时，3'-羟基化黄烷-3-醇含量急速下降，之后小幅波动。花后12周时，3个处理间无显著差异，但单臂篱架处理和60°“V”形架处理的3'-羟基化黄烷-3-醇含量高于30°“V”形架处理。

3 讨论

葡萄果皮中常见的黄烷-3-醇类物质有表棓儿茶素、儿茶素、表儿茶素和表儿茶素没食子酸酯4类[20-21]。‘桂葡6号’葡萄果实生长发育过程中，果皮黄烷-3-醇类物质含量在花后6周时达到最高，在转色过程中大幅度下降，之后含量变化趋势较为平缓。果皮中黄烷-3-醇类物质在转色后发生氧化和降解作用[22-23]，同时，大部分黄烷-3-醇随着果实的发育形成聚合体与细胞壁上的多糖和蛋白结合[24]，从而使葡萄转色后果皮中黄烷-3-醇类物质含量显著降低[25-26]。

将黄烷-3-醇按其B环羟基化程度不同分类，可分为3',5'-羟基化和3'-羟基化两种。由F3'H催化产生的二羟基化（3'-羟基取代）黄烷-3-醇主要有儿茶素和表儿茶素；由F3'5'H催化产生的三羟基化（3',5'-羟基取代）黄烷-3-醇主要有棓儿茶素和表棓儿茶素[16]。本研究中，‘桂葡6号’葡萄果皮中总黄烷醇含量的变化趋势与表棓儿茶素相似，这主要是因为表棓儿茶素在葡萄果皮黄烷醇中占有最高的比例，这与先前该品种的研究结果一致[18]。

表儿茶素与儿茶素虽然只是在C3位的构象不同，但却有截然不同的口感，表儿茶素比儿茶素更加苦涩而且苦涩感觉持续的时间也更长[27]。本研究中，单臂篱架处理果皮中表儿茶素含量在采收期显著高于30°“V”形架和60°“V”形架处理，后两者间无显著差异。这说明，单臂篱架处理‘桂葡6号’果实苦涩感比其它两个处理更强。黄烷-3-醇C3位的羟基基团容易被没食子酸酯化，没食子酸酯化使酒的单宁感变粗糙，而三羟基化黄烷醇能够降低这种粗糙的口感，柔顺酒体[28-30]。本研究中，单臂篱架处理葡萄果皮中表儿茶素没食子酸酯的含量和比例在采收期均显著低于其他两个处理，30°“V”形架处理葡萄果皮中黄烷-3-醇总量和三羟基化黄烷醇的比例最高。由以上分析可以看出，单臂篱架处理可能使后期的葡萄酒单宁粗糙，而30°“V”形架处理有助于提高葡萄酒的柔顺度。

4 结论

本试验研究不同架式对‘桂葡6号’葡萄果皮黄烷-3-醇含量及组分的影响，从提升葡萄酒柔顺度和改善口感的角度考虑，生产上建议‘桂葡6号’选择30°“V”形篱架的整形方式。然而当前缺乏不同架式处理下黄烷-3-醇变化对‘桂葡6号’葡萄酒口感影响的研究，后续将逐步开展，以期为进一步找到适宜的栽培管理措施、改善葡萄酒品质提供理论依据。