叶片湿润时间与田间相对湿度对酿酒葡萄霜霉病发生状况的影响

刘若妍，李文学，顾沛雯*，李嘉鸿

（1. 宁夏大学葡萄酒学院，宁夏银川 750021；2. 宁夏大学农学院，宁夏银川 750021）

葡萄霜霉病是一种世界性葡萄病害。葡萄感病后，可导致叶片早期脱落，果实品质变劣，对树势以及产量造成极大影响[1-2]。国内外研究表明，该病害的发生与田间温湿度以及叶片湿润时间密切相关。在国外，Thind等[3]认为霜霉孢子囊萌发的温度范围为3～30 ℃，最适温度为25～30 ℃。Rumbolz等[4]认为湿度为95%～100%，伴有游离水的存在时是孢子囊形成的最适条件。Gobbin等[5]认为，在田间相对湿度为92%及以上、湿度持续时间超过7 h时葡萄霜霉病即发生。在国内，沙月霞等[6]认为孢子囊萌发温度为5～27 ℃；葡萄霜霉病接种后，在相对湿度76%的条件下即可发生，且湿度越高发病越重。静大鹏等[7]认为葡萄霜霉菌的孢子囊只有在水中才能萌发，菌液与叶片接触时间越长，葡萄霜霉病发生越早，程度越严重。赵胜荣等[8]认为田间相对湿度大于或等于80%时，随着累计天数增加，发病率和病情指数均增长。

目前，国内对叶片湿润时间和田间相对湿度与霜霉病发生状况的研究多数以鲜食葡萄为研究对象，而对酿酒葡萄却鲜有报道。宁夏贺兰山东麓地处世界葡萄种植“黄金地带”[9]，酿酒葡萄种植面积达3.3万 hm2[10]。近年来，随着酿酒葡萄种植面积不断扩大，病虫危害逐年加重，尤其是葡萄霜霉病常年的病情指数可达30%～35%，流行年份的病情指数高达60%[11-12]；霜霉病的流行严重影响酿酒葡萄质量与产量，成为葡萄产业健康发展的主要制约因子之一。针对此情况，本试验以宁夏贺兰山东麓酿酒葡萄为对象，采用离体叶片接种法，研究室内不同保湿条件以及菌液和叶片接触时间与酿酒葡萄霜霉病发生的关系；同时定点监测田间相对湿度，结合田间发病情况调查，研究田间相对湿度对酿酒葡萄霜霉病发生状况的影响。为贺兰山东麓酿酒葡萄霜霉病的有效监测提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试叶片

2018年8 月采集宁夏贺兰山东麓蒲尚酒庄田间‘赤霞珠’和‘紫大夫’葡萄第3～5节位上生长的健叶。用清水冲洗，再用75%的酒精消毒，确保叶片上无虫卵及害虫等干扰因素后，再用无菌水冲洗5次，自然晾干后备用。

1.1.2 供试菌液

田间采集典型葡萄霜霉病菌叶片，用清水冲洗多次，直至将灰尘洗净。接着用小毛笔刷下病叶叶背霉层配置成菌悬液，用移液枪吸取200 μL菌悬液均匀滴加到健康叶背上，然后将健康叶片放在保湿培养箱中24 ℃条件下保湿培养，待健康叶片生长出新的霉层，再用小毛笔刷下配置成菌悬液。用计数板测定其浓度，确保浓度范围在1×106～2×106个/L，备用。

1.1.3 田间相对湿度数据监测

使用佳多农林小气候信息采集系统。利用L92-1温湿度监测器等设备对田间温度（-40～60 ℃，分辨率0.1 ℃）、相对湿度（Relative humidity，RH）（0～100%，分辨率0.1% RH）等数据的采集。

1.2 方法

1.2.1 葡萄霜霉病侵染过程及病原的观察

选择大小基本一致的‘赤霞珠’葡萄第3～5节的健康叶片若干，将叶片叶背朝上放入铺有保湿滤纸的培养皿中，然后在叶背标记5个孢子悬浮液点，用移液枪吸取200 μL制备好的孢子囊悬液滴到健康叶片上，接种3 h后用脱脂棉吸净。将接种好的叶片放到24 ℃、75%RH的保湿培养箱内培养。用体视显微镜观察并记录同一叶片在不同保湿时间下霜霉病的侵染情况，2 h一次，直到症状内眼可见，选择侵染变化明显的情况进行分析。用小毛笔刷下其他叶片在不同保湿时间下新生的霉层，配制成悬浮液，将悬浮液滴在载玻片上，然后正置于荧光相差显微镜下观察病原的形态。

1.2.2 菌液接种时间与保湿条件对霜霉病发生的影响

采用离体叶片接种法，选择大小基本一致的‘赤霞珠’和‘紫大夫’葡萄第3～5节的健康叶片。将样品叶片的叶背朝上放入铺有保湿滤纸的培养皿中，叶柄用湿润的脱脂棉包住，然后在叶背标记5个孢子悬浮液点，再用移液枪吸取200 μL菌悬液分别滴加至每个点，同时以等量清水接种为对照。待菌液分别在葡萄叶片上分别保持1 h、3 h、5 h、7 h后用脱脂棉吸净接种液。将接种完成的叶片放在室内24 ℃、12 h光暗交替，且相对湿度为75%、85%和95%的保湿培养箱内培养，每次处理10片叶，重复3次。观察霜霉病发病始期1 h、3 h、5 h、7 h、9h、12 h、16、20 h、24 h、48 h后的发病情况并计算病情 h指数。

1.2.3 田间相对湿度对葡萄霜霉病发生情况的影响

在7月15日至9月25日期间，监测田间叶幕间温湿度数据，每日间隔1 h记录1次叶片周围温湿度，每日记录24个数值。统计每天田间相对湿度75%及以上持续时间，同时结合每3～5 d的霜霉病发生情况调查。

1.2.4 发病情况调查

室内和田间的病情调查均采用9级记载法[13]，根据病斑

面积占叶面积的百分率划分严重度分级指标：

0级：叶片无病斑；

1级：叶片病斑面积占整个叶面积的5%以下；

3级：叶片病斑面积占整个叶面积的6%～25%；

5级：叶片病斑面积占整个叶面积的26%～50%；

7级：叶片病斑面积占整个叶面积的51%～75%；

9级：叶片病斑面积占整个叶面积的75%以上。

病情指数=[∑(各级病叶数×该级代表值)/(调查病叶盘数×最高级代表值)]×100

1.3 数据分析

应用Excel 2016和IBM SPSS Statistics 25.0对数据进行统计分析，新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 葡萄霜霉菌侵染过程及病原观察

由图1可知，在24 ℃、75%RH的情况下，酿酒葡萄霜霉孢子囊在叶片表面局部的侵染过程。保湿2 h时，叶柄处长出霜霉孢子囊（图1B）；保湿6 h后生出菌丝（图1C）；保湿12 h时，孢子囊产生新的游离孢子，进行大面积侵染（图1D）；保湿20 h时，孢子囊侵染叶片，霜霉病症状肉眼可见（图1E）。

如图2所示，在24 ℃、75%RH的情况下，不同保湿时间下的病原形态。保湿2 h时，有少量孢囊梗和孢子囊存在，霜霉菌的孢囊梗可形成直角分枝，孢子囊无色透明，呈卵圆或椭圆状，无菌丝（图2A）；保湿12 h时，孢囊梗和孢子囊数量增多，且有透明细管状菌丝生成，菌丝与孢囊梗纵横交错（图2B）。

2.2 室内接种时间与保湿条件对酿酒葡萄霜霉病发生的影响

2.2.1 室内接种时间对‘赤霞珠’霜霉病发生的影响

由图3、表1可知，在75%RH的条件下，菌悬液与叶片接触1 h后，最早出现症状时间是保湿5 h；保湿24 h时，叶片可见针状或点状病斑（图3A）。菌悬液与叶片接触3 h后，最早保湿3 h出现症状，病情指数为1.22；保湿7 h后病情指数有明显差异；保湿24 h时，叶片可见点状白色霜霉层（图3B）。菌悬液与叶片接触5 h后，保湿3 h叶片即出现症状；保湿5 h、7 h和9 h对霜霉病的影响程度差异明显；保湿24 h时，叶片可见片状白色霜霉层，发病情况较菌液留存为3 h的叶片更重（图3C）。在菌悬液与叶片接触7 h后，保湿9 h时病情指数达到最高，为20.25；同时霜霉病症状最为严重，保湿24 h时，叶片上霜霉菌丝生长较为密集，连接成白色霉层，面积较大（图3D）。综上所述，在75%RH的条件下，葡萄霜霉病菌悬液与叶片接触1 h即可导致‘赤霞珠’发病，接种后保湿3 h为最早发病时间，需要菌液在叶片上至少留存3 h；接种时间越长，霜霉病出现症状越早、程度越重；同时随着保湿时间增长，接种时间长的叶片发病症状更显著。

2.2.2 不同湿度处理下‘赤霞珠’霜霉病的发病情况

由表2可知，在75%RH、85%RH的条件下，两者保湿5 h前发病情况差异均不明显，但在不同的保湿时间下，85%RH的病情指数均高于75%RH；在95%RH的条件下，保湿1 h后发生状况即有明显变化，且病情指数均高于75%RH、85%RH，保湿20 h时，病情指数达到最高，为42.78；表明在葡萄霜霉病菌悬液与叶片接触3 h后，随着湿度的增高，霜霉病发生的越早，且发病程度越严重。保湿3 h时，75%RH的叶片霜霉病病情指数为1.22，95%RH的病情指数达到8.33，两者相差7.11；而保湿20 h时，75%RH的病情指数是25.56，95%RH的病情指数是42.78，两者相差17.22；说明随着保湿时间的延长，不同湿度之间的差异也越明显，霜霉病在高湿条件下蔓延的速度更快。

表1 菌悬液与叶片接触时间对酿酒葡萄霜霉病发生的影响Table 1 Effect of contact time between bacterial suspension and leaves on downymildew of vitis vinifera (RH=75%)

表2 菌悬液与叶片接触3 h后不同湿度处理下酿酒葡萄霜霉病的发病情况Table 2 The incidence of downy mildew of vitis vinifera under different humidity treatments after contact with the leaves for 3 h

2.3 酿酒葡萄品种在室内条件下霜霉病的发生情况

由表3可知，不同菌液存留时间和相对湿度对不同品种的影响不同。在75%RH的条件下，菌液存留1 h后，‘紫大夫’的病情指数为30.89，大于‘赤霞珠’的病情指数25.56；在菌液存留3 h后，‘赤霞珠’病情指数为41.73，超过了‘紫大夫’的病情指数34.44；表明随着菌液存留时间的增高，‘赤霞珠’侵染速度更快，发病程度更重。在菌液存留1 h的情况下，75%RH和85%RH时，‘赤霞珠’的病情指数均小于‘紫大夫’；但在95%RH时，‘赤霞珠’病情指数高于‘紫大夫’；表明‘紫大夫’发病对湿度以及接种时间的要求相对低于‘赤霞珠’，更易发病；同时表明随着湿度增高，‘赤霞珠’发病速度越快，程度越重。

表3 不同条件下‘紫大夫’和‘赤霞珠’的发病情况（保湿48 h）Table 3 The incidence of 'Dunkelfelder' and 'Cabernet Sauvignon' under different conditions (moisturizing 48 h)

2.4 田间相对湿度对赤霞珠霜霉病发生的影响

由图4可知，在7月20日至24日夜间，叶片平均湿润时间最高达到6 h后霜霉病症状发生，白天则需要达到8 h后才能发生；由于自然湿度条件受环境影响比较大，同时温度和风速会加快干燥的速度，所以延长发生的时间；白天温度较高，干燥的速度比夜晚更快，所以白天需要的时间更长。从8月17日开始，田间湿润时间增多，且夜晚的累计湿润的时间比白天长，同时病情指数增高；在8月18日病情指数为17.93，在10月3日达到57.37；表明夜间湿润对霜霉病的发生和蔓延影响比白天更大，说明霜霉病主要在夜晚传播；随着田间相对湿度持续的时间越长，病害发生程度逐渐加重，这与室内试验结果一致。

3 讨论与结论

目前，国外对霜霉病发生状况的研究报道较多。在位于美国西部沿海，典型的地中海气候的加利福尼亚州，病原体通过雨水和风吹散传播，感染过程需要1.5 h左右，通常发生在早晨[14]。Koopman等[15]认为，在室外霜霉孢子囊的形成相对湿度必须在95%～100%，同时最佳的温度条件是20～25 ℃。Altizer等[16]认为孢子体在一天内形成，其必要条件是在黑暗环境下保持4 h。

沙月霞等[6]学者对贺兰山东麓地区酿酒葡萄霜霉病的发病情况进行研究，明确在贺兰山东麓地区，当室外湿度高于76%时，霜霉病即可发病。本试验研究结果表明，在室内湿度为75%的条件下，葡萄霜霉菌接种后保湿3 h为最早发病的时间；室外环境湿度条件受到的干扰因素较多，所以保湿6 h为葡萄霜霉病最早发病时间，但不排除保湿3 h时有潜在发病隐患；接种时间越长，霜霉病发病越早、越重；湿度的增高，缩短了侵染的时间，使霜霉病的病情指数增高，发病情况也愈加严重。

尽管宁夏贺兰山东麓蒸发量大，有时降雨后并不能维持叶片的湿润[17]，但夏季7—9月平均湿度达到了69%[18]，出现降雨时相对湿度大于80%，远高于本试验霜霉发病的最低湿度。因此，降雨之后，应尽快排水、通风，保证叶片表面干燥，抑制霜霉菌侵染。同时，叶幕间疏密程度对霜霉病的发生也有一定的影响；越密集的叶片越易在降雨、灌溉后造成叶片间高湿的微气候环境，最终导致霜霉病的发生[19-20]。因此，当地可根据病害发生情况，进行适当的叶幕间管理，比如摘叶、打叶、修剪叶片薄厚程度等。

此外，不同酿酒葡萄品种对霜霉病的抗性不同[21]，‘霞多丽’‘美乐’‘品丽珠’等[22-23]品种均易发生霜霉病。本试验通过‘赤霞珠’和‘紫大夫’两个品种进行对比，为进一步探究不同酿酒葡萄品种对霜霉病抗性差异奠定基础。结果表明‘紫大夫’在低湿条件下更易发病；随着湿度条件增高，‘赤霞珠’蔓延速度更快，程度更重。当地种植酿酒葡萄时，尽量不要选择易感病品种或将易感病与抗病品种嫁接种植。

通过在室内和室外定时测定叶幕间的微气候条件，得出葡萄霜霉病在室外湿度为75%的条件下，保湿6 h为霜霉病最早发病时间，但不排除保湿3 h时有潜在发病隐患，因此湿度为75%、保湿3 h应为霜霉病发病的预警；当达到这个条件时，应提前喷施药剂来抑制孢子囊的形成、萌发和侵染。