模拟葡萄汁/葡萄酒体系中白藜芦醇稳定性的研究

张乐宏，朴美子，单凌越，刘淑芬，李岩*

（青岛农业大学食品科学与工程学院，山东青岛 266109）

白藜芦醇（Resveratrol），又称芪三酚，在植物中与糖形成糖苷，常以不变化的反式糖苷和自由态形式存在[1-2]。白藜芦醇在红葡萄酒中的含量一般为1 mg/L，而在白葡萄酒中的含量为0.1～0.2 mg/L[3-4]。陈梦微等[5]研究表明，不同葡萄品种和组织中白藜芦醇含量存在差异，整体表现为果梗＞果皮＞种籽，果皮紫黑色品种＞红色品种＞黄绿色品种。白藜芦醇具有抗肿瘤、抗病毒、抵抗自由基、保护心血管系统等作用[6-9]。

白藜芦醇的稳定性受多种理化因素的影响。缪文玉等[10]的研究表明，白藜芦醇受温度和紫外光的影响比较大，对室内日光灯照射比较稳定。朱屹东等[11]研究表明，较高的温度、pH以及培养基中蛋白胨的存在，均会导致白藜芦醇降解速率的加快；而在低温、酸性及不含蛋白胨的条件下白藜芦醇稳定性较高。郑湘娟等[12]研究表明，在pH为3、白藜芦醇质量浓度0.5 mg/mL、提取温度50 ℃条件下，既会提高白藜芦醇的提取率，又能够保持相对稳定，各因素的影响大小顺序为提取液pH＞提取温度＞白藜芦醇质量浓度＞存放时间。王锟等[13]研究表明，低温避光有利于白藜芦醇的稳定，高温光照不利于白藜芦醇的稳定；在光与热的作用下，白藜芦醇溶液均不稳定。

葡萄酒酿造条件涉及SO2、微量元素、CaCO3、皂土、明胶、聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、活性炭、山梨酸钾、抗坏血酸、橡木片等多种因素。SO2可抑制或推迟葡萄酒中各成分的氧化[14-15]；果胶酶可改善葡萄酒色泽与酒体质量[16-18]；明胶能使酒体清澈，降低色度损失[19-20]；皂土可促进葡萄酒澄清、稳定[21-22]；PVPP对酚类物质具有较强的吸附能力；活性炭能够吸附并除去部分物质；山梨酸钾和抗坏血酸可防止葡萄酒变质；CaCO3可与酒中的酸类进行中和降酸；橡木片能赋予葡萄酒一定的香气[23-24]。上述酿造条件的变化可能影响葡萄酒中白藜芦醇的稳定性。

鉴于葡萄酒成分的复杂性，本研究仅探讨了典型的酿造条件（SO2、皂土、抗坏血酸等）对自由水、葡萄糖、酒精、白藜芦醇、酒石酸构建的模拟葡萄汁和葡萄酒体系中白藜芦醇稳定性的影响。基于维持白藜芦醇的稳定性同时减少损失，本研究为改善葡萄酒酿造工艺、提高葡萄酒质量提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试剂与来源

白藜芦醇标准品：中国药品生物制品检定所；无水乙醇：莱阳康德化工有限公司；酒石酸：河南云创化工有限公司；葡萄糖：苏州全鼎化工科技有限公司；皂土（取5 g皂土于烧杯中，添加80 ℃热水适量消融，然后定容至100 mL，在水浴锅中80 ℃时活化5 h，自然冷却，配制成50 g/L浓度的皂土溶液）：上海试四赫维化工有限公司；明胶（称取0.5 g明胶放到烧杯中，添加一定量40 ℃温水消融，再定容至100 mL，配置成5 g/L浓度的明胶溶液）：法国拉曼公司；PVPP：烟台帝伯仕自酿机有限公司；活性炭：巩义市华康水处理材料有限公司；偏重亚硫酸钾：郑州志远化工产品有限公司；山梨酸钾：泉州众鑫实业有限公司；抗坏血酸：安徽远征生物工程有限公司；CaCO3：天津市燕东浩天矿产品有限公司；橡木片（天然）：北京君悦诚品科贸有限公司。

1.1.2 仪器

BP210S电子天平：珠恒电子有限公司；WH-5600紫外分光光度计：Varian公司；Allegra X-22R高速台式离心机：美国Beckman Coulter有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模拟葡萄汁/葡萄酒体系的构建

本研究模拟葡萄酒酿造过程，参照任健[25]研究报道，构建两种模拟体系（表1）：模拟葡萄汁体系和模拟葡萄酒体系（以真实葡萄酒为参考）。两种模拟体系是基于酒精度和葡萄糖含量的差异而构建，不考虑两种模拟体系中白藜芦醇的实际含量及差异性，仅仅研究不同工艺条件对其白藜芦醇的稳定性的影响。

1.2.2 不同酿造条件对模拟葡萄汁/葡萄酒体系中白藜芦醇稳定性的影响

（1）K2S2O5处理（模拟发酵前工艺）。准确移取配制好的模拟葡萄汁体系溶液5 mL于试管中，以20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L为浓度梯度添加K2S2O5（参照SO2添加量，以确定K2S2O5添加量对白藜芦醇稳定性的影响），无添加组为对照，每个梯度设3组平行，然后置于35 ℃暗室中存放16 h，于306 nm下测其吸光值，白藜芦醇的稳定性以Abs样品/Abs空白表示。

（2）降酸工艺及K2S2O5处理（后发酵工艺）。以0.3 g/L、0.6 g/L、0.9 g/L、1.2 g/L、1.5 g/L为浓度梯度添加CaCO3；以20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L、60 mg/L为浓度梯度添加K2S2O5。将经由以上所获样品置于暗室环境下保存16 h，分别研究二者对模拟葡萄酒体系中白藜芦醇含量的影响。

（3）稳定工艺。以4 g/L、8 g/L、12 g/L、16 g/L、20 g/L为浓度梯度添加活性炭；以60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L为梯度添加明胶；以200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L为梯度添加PVPP；以300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L、700 mg/L为浓度梯度添加皂土，于35 ℃暗室环境下保存16 h，分别研究4者对模拟葡萄酒体系中白藜芦醇含量的影响。

（4）装瓶工艺。以40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L、160 mg/L、200 mg/L为梯度添加山梨酸钾；以40 mg/L、80 mg/L、120 mg/L、160 mg/L、200 mg/L为浓度梯度添加抗坏血酸，于35 ℃暗室环境下保存16 h，分别研究二者对模拟葡萄酒体系中白藜芦醇含量的影响。

（5）陈酿工艺。以1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L为梯度添加橡木片，于35 ℃暗室环境下保存16 h，研究其对模拟葡萄酒体系中白藜芦醇含量的影响。

1.2.3 不同酿造条件对模拟葡萄汁/葡萄酒中白藜芦醇稳定性的相关性分析

对上述不同酿造条件下葡萄汁/葡萄酒模拟体系中白藜芦醇的稳定性进行相关性分析。以横坐标为酿造条件中因素的梯度变化，纵坐标为Abs样品/Abs空白，其中，Abs样品/Abs空白表示模拟葡萄汁/葡萄酒体系中白藜芦醇的稳定性。

2 结果与分析

2.1 K2S2O5对白藜芦醇的影响

本试验中，1分子的K2S2O5可产生1分子的SO2。如图1所示，添加不同浓度的K2S2O5后，与空白相比，模拟葡萄酒体系样品吸光值在总体上有所减小，这表明白藜芦醇含量在一定程度上减少，SO2对白藜芦醇发生了反应。与20 mg/L的K2S2O5添加量相比，30 mg/L、40 mg/L的K2S2O5添加量对模拟葡萄酒体系中白藜芦醇含量呈显著下降趋势；与30mg/L、40 mg/L的K2S2O5添加量相比，50 mg/L、60 mg/L的K2S2O5添加量对模拟葡萄酒体系中白藜芦醇含量也呈显著下降趋势。这可能是由于SO2具有抗氧化作用，其能够与白藜芦醇结构中的双键反应，破坏白藜芦醇的正常结构导致测定吸光值下降。因此，白藜芦醇含量随SO2添加量的增加而显著下降。

如图1所示，随K2S2O5添加量的增加，SO2浓度升高。与空白相比，模拟葡萄汁体系样品吸光值差异不显著。这表明，模拟葡萄汁体系中添加SO2与白藜芦醇相互作用不明显，白藜芦醇含量不变化。这可能是由于模拟葡萄汁体系中含有葡萄糖（180 g/L），SO2能够与糖相结合，生成不稳定化合物，对白藜芦醇起到一定的保护作用。由此可知，白藜芦醇含量在模拟葡萄汁体系随SO2添加量的增添而稳定。

不同体系相比较，在模拟葡萄酒体系中SO2因氧化作用与白藜芦醇结构中双键反应，使之减少；模拟葡萄汁体系中，SO2因糖保护作用与白藜芦醇不反应，保持稳定状态。两种模拟状态下，SO2有着不同的作用，进而对白藜芦醇产生的影响也不同。

2.2 CaCO3对白藜芦醇的影响

如图2所示，CaCO3通常作为一种降酸剂应用于苹果酸-乳酸发酵工艺中。随CaCO3添加量的增加，与空白相比，样品吸光值持续减小，存在显著性。这表明，CaCO3或者酒石酸钙（CaCO3与酒石酸反应生成物）对白藜芦醇有吸附作用，进而使白藜芦醇含量降低。因此，模拟葡萄酒体系中白藜芦醇的含量随CaCO3添加量的增加而减少。

2.3 皂土对白藜芦醇的影响

皂土是一种常见的下胶剂。如图3所示，随着皂土添加量的增加，与空白相比，样品吸光值呈下降趋势，且差异显著。这表明，随着皂土浓度的增大，其对白藜芦醇的吸附作用得到增强，白藜芦醇含量随着皂土添加量的增加而减少。这可能是由于皂土经过活化，其吸附作用得到提升，进而使白藜芦醇含量减少。总之，白藜芦醇含量随皂土添加量的增加而减少。

2.4 明胶对白藜芦醇的影响

如图4所示，与空白相比，随着明胶添加量的增加，样品吸光值整体呈小幅下降趋势。这表明，白藜芦醇含量随明胶添加量的增加而减少。这可能是由于明胶对白藜芦醇的吸附作用微弱，样品组之间试验结果无显著性差异。明胶能通过氢键或疏水基与葡萄酒中酚类化合物发生胶连进而生成聚合物，致使明胶蛋白变性，由原来的亲水胶体转变为憎水胶体，进而与酒体中存在的阳离子彼此吸引，发生凝聚，形成絮状沉淀，从而澄清葡萄酒[26]。模拟体系中的白藜芦醇作为多酚类物质可与明胶蛋白发生聚合反应，形成絮状沉淀，进而减少了白藜芦醇的含量。由图4可知，随着明胶浓度的增加，样品组吸光值变化轻微，可能是由于明胶与白藜芦醇的聚合反应存在限值，与明胶含量的多少无关。由此，推测白藜芦醇随明胶添加量的增加而减少且趋于稳定。

2.5 PVPP对白藜芦醇的影响

PVPP是一种合成下胶剂，其下胶作用温和，既不致使葡萄酒香气丧失，亦可有目的地除去葡萄酒中的酚类物质，在短期内吸附微小残留物，可与其他稳定剂一起使用，以澄清葡萄酒。如图5所示，随PVPP添加量的增加，与空白相比，样品吸光值整体呈下降趋势，且200～400 mg/L范围内的PVPP添加量，样品吸光值大致相平，不存在显著性差异，而500 mg/L、600 mg/L样品组与200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L样品组吸光值存在显著性差异。这可能是由于PVPP下胶后，随着其浓度增大，吸附效果得到提升，与葡萄酒中易发生褐变及产生涩味的酚类物质结合，短期内有效除去细微残渣，快速澄清溶液。模拟葡萄酒体系中白藜芦醇作为多酚类物质，极易被PVPP吸附，白藜芦醇含量下降增多。因此，整体而言，白藜芦醇的含量随PVPP添加量的添加而减少。

2.6 活性炭对白藜芦醇的影响

如图6所示，随活性炭添加量的增加，与空白相比，样品吸光值呈下降趋势，且吸光值减小的幅度较大，且存在显著性差异。活性炭的添加量自4 g/L上升至16 g/L时，样品吸光值逐渐减小，这是由于活性炭的吸附强度随添加量的增加而增强。活性炭添加量为20 g/L时，该试验组吸光值出现骤增趋势，其原因可能是活性炭添加量过高，干扰了吸光值的测定。这表明，随着活性炭添加量的增加，其对白藜芦醇的吸附作用得到增强，白藜芦醇含量大幅度减少。

由图3～图6可知，稳定工艺中，皂土、明胶、PVPP、活性炭等4种澄清剂皆因自身的吸附能力而使模拟葡萄酒体系中的白藜芦醇出现减少的现象，但在吸附能力与原理方面存在差异。

2.7 山梨酸钾对白藜芦醇的影响

如图7所示，随山梨酸钾添加量的增加，与空白相比，样品吸光值随着山梨酸钾添加量的增加而呈上升趋势。由于山梨酸钾与白藜芦醇均存在共轭双键结构，故在306 nm处山梨酸钾与白藜芦醇可能存在紫外吸收峰，这在一定程度上造成所测样品吸光值大于原始值。

2.8 抗坏血酸对白藜芦醇含量的影响

如图8所示，随抗坏血酸添加量的增加，与空白相比，吸光值连续减小，且存在显著性差异。这表明，模拟葡萄酒体系中白藜芦醇的浓度呈下降趋势，且存在显著性差异。抗坏血酸具有很强的还原性，即抗氧化作用。在装瓶前添加到葡萄酒中，可使酒中溶氧与其反应，减少溶氧量，防止破坏，与白藜芦醇无反应。图8中吸光值的下降可能是由于模拟葡萄酒体系中添加的是溶液，抗坏血酸溶液的添加对模拟葡萄酒体系起到稀释作用而使白藜芦醇浓度变小，吸光值呈现下降趋势。

2.9 橡木片对白藜芦醇的影响

如图9所示，随天然橡木片添加量的增加，与对照相比，1～2 g/L的橡木片添加量，样品吸光值有所减小，3～5 g/L的吸光值要有所增加，1～2 g/L的橡木片添加量与3～5 g/L的橡木片添加量在对模拟葡萄酒体系中白藜芦醇含量的影响效果存在显著性差异。由此，可推断橡木片添加量为1～2 g/L时，其对白藜芦醇含量无影响或有轻微的吸附作用。橡木片中存在的单宁等复杂的多酚类物质，在葡萄酒陈酿进程中会浸渍到溶液中，使酿制的葡萄酒更符合人们的口味。模拟体系中的酒精成分会使添加的橡木片中成分浸出，橡木片浸出物如单宁、木质素等在306 nm下存在着吸光值，对3～5 g/L来说，添加量越多，浸出物质多，吸光值越大。

2.10 不同酿造条件与模拟葡萄汁/葡萄酒体系中白藜芦醇稳定性的相关性分析

图10中，纵坐标数值＞1表示该酿造条件对葡萄汁/葡萄酒体系吸光值比空白组吸光值大，说明该酿造条件对白藜芦醇的稳定性影响不明确；纵坐标数值＜1表示该酿造条件对葡萄汁/葡萄酒体系吸光值比空白组吸光值小，说明在该酿造条件下白藜芦醇的稳定性降低或使其含量减少。由图10可知，随着不同酿造条件添加量的增加，不同酿造条件对模拟葡萄汁/葡萄酒体系中白藜芦醇含量的影响存在差异。在该研究中，只在模拟葡萄汁体系中添加K2S2O5对白藜芦醇含量的影响效果更为明显。在模拟葡萄酒体系中，各因素对模拟体系中白藜芦醇含量的影响顺序为：橡木片＞山梨酸钾＞明胶＞ K2S2O5＞抗坏血酸＞CaCo3＞皂土＞PVPP＞活性炭。

3 结论

本研究通过单因素实验分析比较10种酿造工艺条件对模拟葡萄汁及葡萄酒体系中白藜芦醇稳定性的影响，结果表明，在不同模拟体系下，K2S2O5对白藜芦醇的稳定性影响不同。装瓶时，山梨酸钾与抗坏血酸对白藜芦醇稳定性无影响；而鉴于明胶、皂土、PVPP、活性炭等下胶剂的吸附作用，而对白藜芦醇稳定性有较大影响，使得白藜芦醇含量出现下降趋势，且不同的下胶剂作用程度不同。CaCO3的降酸作用对白藜芦醇稳定性有较大影响。而橡木片则对白藜芦醇的稳定性无影响或影响轻微。由于该研究只是利用简单的模拟体系分析测定白藜芦醇的稳定性，然而，未考察真实的葡萄酒或葡萄汁中复杂体系（如单宁、胶体、色素等）对白藜芦醇稳定性的影响，还有待进一步研究。