贺兰山东麓老葡萄园卷叶病田间危害调查及分子检测

黄强，张强强，顾沛雯

（宁夏大学农学院，宁夏银川 750021）

葡萄病毒病是制约葡萄产业健康发展的主要因素，葡萄卷叶病（Grapevine leafroll disease，GLD）是造成严重经济损失的系统性病毒病害之一[1]。在我国，卷叶病分布较广，凡有葡萄栽培的地区都有该病的存在，其中北京、河北、天津、山东和宁夏发生较重[2]。该病病原是葡萄卷叶伴随病毒（Grapevine leafroll-associated viruses，GLRaVs）。迄今为止，全世界已报道了6种葡萄卷叶伴随病毒，分别为GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GLRaV-4（包括GLRaV-4的变种GLRaV-5、GLRaV-6、GLRaV-9、GLRaV-Pr、GLRaVDe、GLRaV-Car）、GLRaV-7和GLRaV-13，均属于长线病毒科（Closterovoridae）[3-5]。

葡萄卷叶病的典型症状是葡萄树体感染病毒后，下部叶片先表现症状，叶片向下翻卷，并逐渐向上部叶片扩展，因卷缩而发脆。Maree等[6]研究发现，葡萄植株感染卷叶伴随病毒后，树势会受到严重影响，植株寿命显著缩短。徐美隆等[7]研究发现，葡萄植株在感染卷叶伴随病毒后，其叶片组织中的叶绿素含量减少，感病植株光合速率明显减弱。刘万好等[8]通过检测感染卷叶病的‘蛇龙珠’葡萄成熟果实理化指标发现，其还原糖含量比正常植株最多降低24.05%，含酸量是正常植株的1.4倍。目前，葡萄卷叶病无法通过化学药剂进行有效控制，防治方法主要通过栽植脱毒苗木。随着葡萄种植年限的增加，老园感病率和感病程度正逐年提高，因此建立高效准确的检测方法，是早期诊断和防治葡萄卷叶病的关键措施。

近几年，常用于检测GLRaVs的方法有：生物学方法、血清学方法、免疫电镜、双链RNA分析、标记探针杂交和RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）等[9]，其中，生产实际环节中应用最为广泛的是RT-PCR技术。李晨等[10]利用RT-PCR方法对6个葡萄品种进行了14种葡萄病毒的检测，共检测出13种葡萄病毒，其中分布较广的为沙地葡萄茎痘相关病毒（GRSPaV）、葡萄斑点病毒（GFkV）和葡萄卷叶伴随病毒3（GLRaV-3）。吕苗苗等[11]采用RT-PCR方法，对贺兰山东麓地区40份样品进行GLRaV-1～GLRaV-5这5种葡萄卷叶伴随病毒的检测，共检出3种病毒类型，其中GLRaV-3的检出率最高，为87.5%。葡萄卷叶伴随病毒为RNA病毒，由于其在自我复制过程中缺乏矫正机制，极易发生变异[12]，顾沛雯等[13]对宁夏地区的酿酒葡萄进行了RT-PCR检测，经基因同源性比对研究，发现GLRaV-3宁夏分离物的CP基因可能存在分子变异。且有大量研究表明葡萄病毒可以通过介体昆虫如粉虱、叶蝉和蚜虫等传播，进而进一步扩大危害范围，因此有必要重新对不同地区酿酒葡萄卷叶病进行全面的调查和检测，这对指导该地区葡萄卷叶病的早期监测和防控具有重要意义。

本研究通过对贺兰山东麓地区老葡萄园酿酒葡萄卷叶病的调查及检测，旨在明确贺兰山东麓地区酿酒葡萄卷叶伴随病毒的携带状况，并对目前当地主栽酿酒葡萄品种健康状况进行综合评估，为宁夏酿酒葡萄病毒病的早期诊断和建立葡萄脱毒苗繁育技术体系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料

供试品种为‘蛇龙珠’‘美乐’‘赤霞珠’‘贵人香’和‘霞多丽’5个品种，树龄均在10年以上。上述供试品种分别采自贺兰山东麓4个种植区代表性葡萄园，其中石嘴山种植区选择贺东庄园，银川种植区选择新牛酒庄和志辉源石酒庄，永宁种植区选择立兰酒庄和西夏王酒庄，青铜峡种植区选择西鸽酒庄。

1.1.2 主要仪器与试剂

Simpli Nano超微量分光光度计（GE Healthcare公司，美国）；C200全自动凝胶成像仪（Azure Biosystems 公司，美国）；T100TM PCR仪（Biorad公司，美国）；DYY-6C电泳仪（北京六一厂，中国）；3K15冷冻离心机（Sigma公司，美国）；LE204E电子分析天平（Mettler-toledo公司，瑞士）。

RNA提取试剂盒（Kit R6827，Omeg公司，美国）反转录试剂盒（EasyScript® All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal），北京全式金生物有限公司，中国）。

1.2 方法

1.2.1 田间危害调查

2021年6—9月，对贺兰山东麓4个种植区6个酒庄的5个主栽酿酒葡萄品种进行葡萄卷叶病的田间自然发病情况调查，并记录其危害症状。每个葡萄园每品种选择一块样地，每样地随机选取10行，每行随机选取3个小区，每个小区范围是2个架杆间的葡萄植株，区间内进行逐行逐株调查发病情况。按吕苗苗等[11]的方法对植株发病严重程度进行分级，计算发病率和病情指数。

严重度按5级标准进行分级：0-无症状；1-仅在枝条基部老叶上有轻微卷叶病症状；2-植株有1/3以下的叶片有卷叶病的症状；3-植株上有1/3～1/2的叶片有卷叶病症状；4-植株上有1/2以上的叶片有卷叶病症状[11]。

发病率（%）=(病株数/调查总株数)×100

病情指数＝∑(各级病株数×该病级值)/(调查总株数×最高级值)×100

1.2.2 RT-PCR样品采集方法

每个品种在设置的小区内，随机选择单株进行叶片采集。具体操作为每单株分上、中、下部各取1片叶，迅速用锡箔纸包好，作为一个样品。标记好采集地点、品种等信息，置于液氮罐中，带回实验室置于-80 ℃冰箱中保存，备用。共计92份样品。

1.2.3 RNA提取及cDNA的合成和PCR检测

在样品中加入液氮并迅速研磨至粉末状，转移100 mg粉末到1.5 mL的离心管中，使用Plant RNA Kit R6827试剂盒进行总RNA的提取。将提取出的总RNA使用EasyScript® All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removal）试剂盒反转录成cDNA，采用表1中的特异性引物对样品中的病毒进行检测。PCR扩增反应体系（25 μL）：Max Taq酶12 μL，上、下游引物各1 μL，RNase-free Water 9 μL，cDNA 2 μL；PCR扩增条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 3 min，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测产物。PCR产物由测序公司进行测序。

表1 RT-PCR所用引物Table 1 Primers used in RT-PCR

1.2.4 数据处理

利用Microsoft Excel 2019与SPSS 20.0对92份样品检测结果进行分析整理，计算发病率和病情指数。从GenBank中获得3种卷叶伴随病毒不同地理来源的基因序列（表2），利用Mega 7.0软件对测序结果进行多重比对，分析不同毒株分离物间的核酸序列相似性并构建系统发育进化树。

表2 用于构建系统发育树的参比序列Table 2 Reference sequences used to construct phylogenetic trees

2 结果与分析

2.1 老葡萄园卷叶病的田间症状

贺兰山东麓酿酒葡萄卷叶病于7月上旬开始，田间陆续可见发病症状，前期症状表现为植株叶片叶缘轻微反卷（图1 A）。不同酿酒葡萄品种感染卷叶伴随病毒后，表现出的症状不同。随着葡萄生长，红色品种感病植株叶片开始出现大小不等的红斑，叶片反卷幅度加重，叶肉开始逐渐加厚。葡萄成熟以后，感病症状最为明显，表现为植株叶片各红斑连接面积扩大，叶脉保持绿色，叶片反卷皱缩（图1 B）。白色品种感病植株前期症状与红色品种相同，但后期叶片向后反卷并未变红，叶片组织叶绿素含量变低，表现出褪绿黄化的症状（图1 C）。红色和白色品种感染卷叶伴随病毒后，植株果实发育不良，果粒变小，着色不明显（图1 D）。

图1 老葡萄园酿酒葡萄品种卷叶病症状Figure 1 Symptoms of leafroll-associated disease of wine grape varieties

2.2 老葡萄园酿酒葡萄卷叶病感病状况

2.2.1 不同种植地区发病情况差异

由表3可知，永宁种植区的发病程度最重，其次是青铜峡种植区，银川种植区发病程度最轻。在4个种植区的6个酒庄葡萄园中，西夏王酒庄葡萄园发病最严重，平均发病率和病情指数显著高于其他酒庄，分别为66.43%和41.43；其次是新牛酒庄葡萄园，平均发病率和病情指数分别为42.72%和22.1。志辉源石葡萄园发病程度最轻，平均发病率和病情指数显著低于其他酒庄的葡萄园，分别为5.64%和1.89。说明贺兰山东麓不同种植地区葡萄卷叶病的发病率与发病程度有很明显的差异。

表3 贺兰山东麓不同种植区老葡萄园酿酒葡萄卷叶病田间自然发病情况Table 3 Natural incidence investigation in different planting areas of old vineyard with grapevine leafroll-associated disease in the east foot of Helan Mountains

2.2.2 不同品种间发病情况差异

由表4可知，不同品种的发病率和发病程度各有差异。其中‘蛇龙珠’发病最为严重，其平均发病率和病情指数都显著高于其它品种，分别为70.47%和43.32。‘美乐’次之，其平均发病率和病情指数分别为37.67%和20.59；‘霞多丽’发病程度最轻，其平均发病率和病情指数分别为20.62%和9.16，显著低于其他品种。说明‘蛇龙珠’和‘美乐’属卷叶病易感品种。

表4 贺兰山东麓不同酿酒葡萄品种间葡萄卷叶病自然发病情况Table 4 Natural incidence investigation of different wine grape varieties grapevine leafroll-associated disease in the east foot of Helan Mountains

2.3 酿酒葡萄卷叶伴随病毒RT-PCR检测

2.3.1 RT-PCR检测结果

92份样品中检测到3种卷叶伴随病毒。由表5可知，分别为GLRaV-1、GLRaV-2和GLRaV-3，其中GLRaV-3的平均检出率最高，为70.17%。5个品种均检测到GLRaV-1和GLRaV-3。‘蛇龙珠’中GLRaV-1平均检出率最高，为75.00%；其次是‘美乐’，为66.67%；‘贵人香’和‘霞多丽’GLRaV-1的检出率最低，均为50.00%。‘赤霞珠’‘美乐’和‘贵人香’均检测到了GLRaV-2，其中‘贵人香’GLRaV-2的检出率最高，为41.67%；其次是‘赤霞珠’，检出率为25.00%；‘美乐’GLRaV-2的检出率最低，为16.67%。‘蛇龙珠’GLRaV-3的检出率最高，为83.33%；其次是‘赤霞珠’，为79.17%；‘霞多丽’的检出率最低，为55.00%。此外，5个品种GLRaV-3的检出率均大于50.00%。

表5 葡萄卷叶伴随病毒RT-PCR检出率Table 5 RT-PCR detection rate with grape leafroll-associated virus %

在5个酿酒葡萄品种中发现，‘蛇龙珠’和‘霞多丽’两品种存在二重复合侵染现象，其中‘蛇龙珠’二重复合侵染率最高，为83.33%；‘贵人香’‘美乐’和‘赤霞珠’3个品种存在三重复合侵染现象，其中‘贵人香’的三重复合侵染率最高，为33.33%；‘赤霞珠’三重复合侵染率最低，为16.67%。综合来看，‘蛇龙珠’GLRaVs的检出率是5个品种中最高的，即在所有调查的品种中，‘蛇龙珠’是卷叶伴随病毒主要侵害的酿酒葡萄品种。

2.3.2 RT-PCR产物测序结果分析

92份样品中，共获得了12个不同来源的GLRaV-1阳性分离物，由图3所示。经序列比对分析发现，样品新牛-蛇龙珠、西夏王-蛇龙珠、西鸽-霞多丽、西夏王-赤霞珠、西鸽-赤霞珠、志辉-美乐、贺东-美乐，与样品西鸽-蛇龙珠分离的毒株序列相似，聚在了同一分支，而上述8个样品与样品新牛-美乐分离的毒株序列相似，聚在了同一分支，它们与来自加拿大的GLRaV-1HSP基因分离物（登录号：MH807217）相似度高，同源率为98.6%；样品志辉-贵人香分离的毒株与来自加拿大的另一种GLRaV-1HSP基因分离物（登录号：MH807220）聚在了同一分支，同源率为96.7%。样品新牛-贵人香分离的毒株与来自匈牙利的GLRaV-1HSP基因分离物（登录号：MF677861）聚在了同一分支，同源率为98.3%。样品新牛-霞多丽与来自土耳其的GLRaV-1HSP基因分离物（登录号：KU362239）聚在了同一分支，同源率为95.3%。上述12个样品与来自法国的GLRaV-1HSP基因分离物（登录号：MG925331）相似度高，同源率为90.3%（图3）。

图3 GLRaV-1 HSP基因的RT-PCR检测Figure 3 RT-PCR detection of GLRaV-1 HSP

试验共获得了4个不同来源的GLRaV-2阳性分离物。经序列比对分析发现，样品贺东-美乐、立兰-美乐、西夏王-赤霞珠、志辉-贵人香与葡萄牙GLRaV-2CP基因分离物（登录号：KM012097）分离的毒株序列相似度高，聚在了同一分支，同源率为99.4%（图4）。

图4 GLRaV-2 CP基因的RT-PCR检测Figure 4 RT-PCR detection of GLRaV-2 CP

92份样品共获得了11个不同来源的GLRaV-3阳性分离物。经序列比对分析发现，样品志辉-贵人香、西夏王-赤霞珠分离的毒株与来自意大利GLRaV-3CP基因分离物（登录号：MT432385）聚在了同一分支，同源率为99.4%；样品西夏王-赤霞珠分离的毒株与来自巴西GLRaV-3CP基因分离物（登录号：KJ704369）聚在了同一分支，同源率为98.9%；样品西鸽-赤霞珠分离的毒株与来自希腊GLRaV-3CP基因分离物（登录号：LR215339）聚在了同一分支，同源率为99.1%；样品新牛-蛇龙珠分离的毒株与来自中国北京GLRaV-3CP基因分离物（登录号：KC477138）聚在了同一分支，同源率为99.0%；样品贺东-赤霞珠和立兰-赤霞珠分离的毒株与来自南非GLRaV-3CP基因分离物（登录号：JQ655295）聚在了同一分支，但进化分支长度较长，同源率为95.1%（图5）。

图5 GLRaV-3 CP基因的RT-PCR检测Figure 5 RT-PCR detection of GLRaV-3 CP

3 讨论与结论

该研究调查了贺兰山东麓4个种植区的酿酒葡萄感染卷叶伴随病毒的类型和卷叶病染病情况。在贺兰山东麓的主要酿酒葡萄品种中，‘蛇龙珠’‘美乐’‘霞多丽’等品种均有感染卷叶病的情况发生。其中西夏王酒庄的发病率和病情指数均较高，志辉酒庄的最低，其他酒庄葡萄园发病率和发病严重程度也各有差异，分析认为可能是由于葡萄园早期引进与栽植的种苗检疫手段缺乏或不完善造成的。其次，在所有调查的品种中，‘蛇龙珠’的平均发病率最高，‘霞多丽’的平均发病率最低。其他酿酒葡萄品种发病率和发病严重程度也各有差异，可能与不同品种对卷叶病的抗病差异性有关。

该研究对贺兰山东麓酿酒葡萄进行了6种GLRaVs（GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GLRaV-4、GLRaV-7、GLRaV-13）的RT-PCR检测，检测出3种卷叶伴随病毒，分别为GLRaV-1、GLRaV-2和GLRaV-3，其中GLRaV-3的检出率最高，这与吕苗苗等[11]的调查结果相一致。本研究在5个酿酒葡萄品种上均检测出不同的卷叶伴随病毒，‘蛇龙珠’和‘霞多丽’品种存在GLRaV-1和GLRaV-3两种卷叶伴随病毒的复合侵染，‘赤霞珠’‘美乐’和‘贵人香’存在GLRaV-1、GLRaV-2和GLRaV-3三种卷叶伴随病毒的复合侵染。分析认为，这可能是由于宁夏酿酒葡萄在发展初期葡萄病毒检测体系尚不健全的情况下，大量引进砧木与欧亚种葡萄品种进行嫁接，带毒苗木进入葡萄园所导致。此外，病毒长期的积累，加上叶蝉、粉蚧等昆虫的传播，也是造成老葡萄园出现严重卷叶伴随病毒复合侵染的原因之一。

GLRaV-1和GLRaV-3分离株系存在明显变异，李文学等[20]对宁夏不同葡萄品种GLRaV-1和GLRaV-3CP基因分离物进行单链构象多态性（SSCP）技术和聚类分析发现，GLRaV-1和GLRaV-3均存在两种变异类群。Turturo等[21]利用SSCP技术对45个葡萄样品GLRaV-3CP基因变异的研究发现，GLRaV-3CP基因的变异几率较大。本研究发现，12个不同来源的GLRaV-1HSP基因阳性分离物与来自加拿大的GLRaV-1HSP基因分离物、来自匈牙利的GLRaV-1HSP基因分离物、来自土耳其的GLRaV-1HSP基因分离物相似度高，该基因的核苷酸序列一致性为90.3%～98.6%；此外，在3个不同品种上均检测到了GLRaV-2，4个不同来源样品的GLRaV-2CP基因阳性分离物与来自葡萄牙GLRaV-2CP的基因分离物相似度高，同源率为99.4%，尚未发现该基因有明显差异；在11个不同来源样品的GLRaV-3CP基因阳性分离物中，样品贺东-赤霞珠和立兰-赤霞珠分离的毒株与南非GLRaV-3CP基因分离物的同源率为95.1%，这三种毒株进化分支长度较长，且同源率低。GLRaV-1HSP基因与GLRaV-3CP基因在系统发育树上明显分化为多个分支，分析认为，GLRaV-1HSP基因与GLRaV-3CP基因可能存在变异并分别分化出了多种不同的株系。上述结果表明，贺兰山东麓产区不同酿酒葡萄品种所感染的GLRaVs中，GLRaV-1HSP基因与GLRaV-3CP基因存在差异和变异，具体存在哪种形式变异还尚待研究。

目前，葡萄病毒病无法利用化学药剂进行有效控制，主要通过栽植脱毒苗、防治传毒介体和加强栽培管理等方法进行防治，其中栽植脱毒苗木是最经济有效的方法，嫁接时也应采用无毒的砧木和接穗[22]。国内葡萄苗木脱毒方法有使用茎尖培养脱毒、热处理与茎尖培养相结合脱毒、化学疗法与茎尖培养相结合脱毒和茎尖超低温疗法脱毒。此外葡萄园里的粉蚧、蚜虫和蓟马等昆虫可传播葡萄病毒[23]。在生产上应抓住这些传毒介体的关键防治时期，加强传毒介体的防治，防止病毒的传播蔓延。同时加强水肥管理、合理负载，增强树势，提高树体抵抗力，在每年夏秋季对葡萄园调查两次，若发现严重发病的病株，应及时刨除。修剪时也应注意果枝剪的消毒，防止病毒通过果枝剪上残留的汁液进行传播。