不同前处理-GFAAS法测定葡萄酒中铜、铁元素含量的技术研究

蒋娟，刘宇航，梁艳英,3，张予林,3*

（1. 西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌 712100；2. 陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心，陕西杨凌 712100；3. 西北农林科技大学合阳葡萄试验示范站，陕西合阳 715300）

葡萄酒中含有氨基酸、维生素以及多种矿质元素（包括微量元素），是一种营养丰富的饮料，适当饮用有延缓衰老、益寿延年的效果[1]。葡萄酒中的Cu2+、Fe3+是氧化还原系统的重要因子，在葡萄酒陈酿中发挥重要作用，对葡萄酒的澄清和风味有很大影响。但过量的铜（Cu）会影响酒体的稳定性，加快葡萄酒氧化，使酒体产生浑浊和沉淀，影响酒的色泽和口感[2]；过量的铁（Fe）可与白葡萄酒中的磷酸盐或红葡萄酒中的单宁形成难溶性物质，导致葡萄酒浑浊，产生铁破败病[3-4]。因此，葡萄酒中Cu、Fe元素含量的准确测定对于葡萄酒酿造和毒理学方面的研究具有重要意义[5]。

国家标准GB/T 15037—2006规定[6]，葡萄酒中Fe含量不超过8.0 mg·L-1，Cu含量不超过1.0 mg·L-1。目前，常用于Cu、Fe元素含量测定的方法主要包括火焰原子吸收光谱法（FAAS）[7]、电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）[8]、毛细管电泳法和石墨炉原子吸收光谱法（GFAAS）[9]等。其中GFAAS具有灵敏度高、检出限低、进样体积少、减少化学干扰、原子化效率高的优点，在食品重金属元素测定中被广泛应用[10]。本实验对GFAAS测定葡萄酒中Cu、Fe元素的灰化温度、原子化温度条件进行研究，对比湿法消解法、干法消解法、直接稀释法3种不同前处理方法的优缺点，拟建立一套测定葡萄酒中Cu、Fe元素含量准确、高效的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：干红葡萄酒，干白葡萄酒成品。

试剂：Cu、Fe标准溶液质量浓度均为1000 mg·L-1，来自国家有色金属及电子材料分析测试中心；浓硝酸65%～68%（Vol），优级纯，洛阳昊华化学试剂有限公司；浓盐酸36%～38%，优级纯，四川西陇科学有限公司；实验用水均为超纯水（电阻率18.2 MΩ·cm）；仪器洗针液为0.5%（Vol）硝酸溶液。

试验中所使用玻璃和塑料器材等均用20%HNO3（Vol）浸泡24 h，直接用纯水清洗后晾干，再重复以上步骤一次后待用。瓷坩埚浸泡冲洗后在马弗炉中空烧6 h。

仪器设备：AA240Z安捷伦石墨炉原子吸收光谱仪，美国Agilent公司；Milli-Q超纯水系统，美国Millipore公司；SX-5-12数显马弗炉（箱式电阻炉），北京科伟永鑫实验仪器设备厂；海能SH230N重金属消解仪；昆山舒美KQ-250E超声波清洗器；恒温水浴锅；可调式电热炉。

1.2 标准溶液配制

吸取适量单元素标准贮备液，用0.5%硝酸溶液逐级稀释至200 μg·L-1，由原子吸收自动进样器稀释至Cu、Fe标准系列溶液浓度，各元素质量浓度范围见表1。

表1 Cu、Fe元素标准溶液质量浓度Table 1 Mass concentrations of standard solutions for Cu and Fe μg·L-1

1.3 样品前处理

1.3.1 湿法消解法

吸取10 mL酒样置于50 mL消解管中，放入重金属消解仪中120 ℃加热蒸发乙醇浓缩至4～5 mL，加入8 mL硝酸，设置加热温度为160～180 ℃，消解至无大量黄烟冒出，取下后加入2 mL过氧化氢，继续消解至消化液呈透明略带黄色，赶酸至剩余3～4 mL溶液，取下放冷后将消化液转移至25 mL容量瓶中，用0.5%硝酸溶液少量多次洗涤消解管，合并洗涤液于容量瓶中定容。同时做空白试验[11]。Fe元素测定时需再稀释10～20倍。

1.3.2 干法消解法

准确移取酒样10.0 mL于坩埚中，恒温水浴锅80 ℃条件下蒸干酒样，然后放至可调式电热炉上小火炭化至无烟冒出后，转移至箱式电阻炉（马弗炉）550 ℃灰化4～5 h。冷却，取出。加2 mL硝酸溶液（1+1）溶解，移入50 mL容量瓶中，用水洗涤坩埚，洗涤液并入容量瓶中，加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。

1.3.3 直接稀释法

取1 mL样品于50 mL塑料容量瓶中，加入2 mL 5%硝酸反应10 min后定容至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。

1.4 仪器测定条件

实验中选择Fe的测定波长是372.0 nm，狭缝宽度0.2 nm，灯电流5.0 mA；Cu的分析波长是327.4 nm，狭缝宽度0.5 nm，灯电流4.0 mA。进样体积为10 μL，以高纯氩气为保护气体。

选用表1中配置的40 μg·L-1Cu标准溶液和80 μg·L-1Fe标准溶液作为测试溶液，在不加基体改进剂的情况下，通过测定标准溶液的吸光度与灰化温度、原子化温度的关系来选定最佳灰化温度和最佳原子化温度。

1.5 方法评价

1.5.1 方法的灵敏度

通过检测限LOD（产生高于系统噪声水平可检测到响应的最低分析物浓度）、定量限LOQ（可准确和精确测量分析物的最低水平）和标准曲线的斜率（S）评估方法的灵敏度[12]。

LOD=3σ/S

LOQ=10σ/S

其中：σ代表空白样品多次测量值的标准差（n=12），S代表分析曲线斜率。

1.5.2 方法的准确度

为了验证不同前处理方法测定结果的可靠性，选取干红、干白酒样各一款加入一定量的待测物质，然后与样品同时进行前处理和测定实验，计算加标回收率。

加标回收率（%）= (C1－C0)/C'×100

式中：C1代表加标后样品中的金属浓度，C0代表加标之前样品中的金属浓度，C'代表加到酒中的分析物的标准浓度[12]。

每种金属的加标浓度各设低、中、高三个水平，其中Fe元素按照低、中、高水平加标浓度分别为1.0、2.0、3.0 mg·L-1；Cu元素的低、中、高加标浓度分别为100、200、300 μg·L-1。

选择白、红葡萄酒各一款，利用新建方法对样品中Fe和Cu元素含量重复测定6次，计算相对标准偏差（RSD，%），评估方法的精密度。

1.6 数据统计分析

借助数据处理软件DPS V6.50 获得实验数据的单因素方差分析结果（Duncan新复极差法），每个处理重复6次。利用Microsoft excel 2010和Origin 2018进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 仪器工作条件优化

2.1.1 Cu的灰化温度和原子化温度的选择

石墨炉升温过程可分为4个阶段，即干燥、灰化、原子化和净化。干燥温度一般稍高于溶剂沸点，目的是除去溶剂，以免溶剂在灰化和原子化阶段的飞溅。灰化即保证被测元素在无损失的前提下，尽量除去样品中易挥发的基体和有机物，以减少甚至完全消除基体干扰[11]。在实际应用中，选择被测元素不损失的最高温度。在原子化阶段，选用达到最大吸收信号的最低温度作为原子化温度，同时应该使用最大升温速率使石墨管温度上升至设定的原子化温度。如图1所示，Cu的最佳灰化温度是600 ℃，最佳原子化温度是2300 ℃。

图1 Cu的灰化温度和原子化温度的选择Figure 1 The ashing temperature and atomization temperature for Cu

2.1.2 Fe的灰化温度和原子化温度确定

通过测定不同灰化温度和原子化温度下80 μg·L-1Fe标准溶液的吸光度（图2），确定Fe的灰化温度是600 ℃，最佳原子化温度是 2300 ℃。因此，本次实验石墨炉升温程序见表2。

图2 Fe的灰化温度和原子化温度的选择Figure 2 The ashing temperature and atomization temperature for Fe

表2 测定Cu、Fe元素的石墨炉加热程序Table 2 Heating program of graphite furnace for determining Cu and Fe

2.2 标准工作曲线和灵敏度

2.2.1 标准曲线的绘制

设置进样量20 μL，按表2升温程序测定Cu、Fe标准系列溶液，得到Cu、Fe标准曲线。Cu标准曲线为y=0.0042x＋0.0319（图3），斜率为0.0042，截距为0.0319，决定系数R2为0.9974；Fe标准曲线为y=0.0023x＋0.0078，斜率为0.0023，截距为0.0078，决定系数R2为0.9979，说明在所设质量浓度范围内线性关系良好，且Cu标准曲线的截距更大，说明用石墨炉原子吸收光谱法测Cu的灵敏度更高。

图3 Cu 标准溶液的标准曲线Figure 3 Standard curve of standard solution for Cu

图4 Fe 标准溶液的标准曲线Figure 4 Standard curve of standard solution for Fe

2.2.2 检出限及定量限

通过测定12次空白的标准差，并除以分析曲线的斜率S可知，Cu、Fe的LOD值分别是0.58 μg·L-1和1.15 μg·L-1，LOQ值分别是1.94 μg·L-1和3.85 μg·L-1。说明用石墨炉法测定葡萄酒中Cu、Fe元素含量的灵敏度较高。

2.3 不同前处理比较

2.3.1 不同前处理方式测定结果比较

选用已知本底值的干红、干白酒样，进行3个不同添加水平的加标回收实验，每个水平平行测定6次，计算RSD，结果见表3和表4。

表3 不同前处理方法测定Cu元素含量的比较（n = 6）Table 3 The comparison of measured Cu based on different sample pretreatment methods

表4 不同前处理方法测定Fe元素含量的比较（n=6）Table 4 The comparison of measured Fe based on different sample pretreatment methods

由表3、表4可知，除干红酒样不同前处理方法间Cu的含量差异明显外，其余不同前处理间本底值无显著性差异。采用3种前处理方法测定Cu、Fe元素的加标回收率分别为90.37%～114.03%和86.85%～118.99%，Cu的加标回收率更接近100%，表明用石墨炉原子吸收光谱法测葡萄酒中Cu的准确度高于测Fe。对比不同前处理方法发现，湿法消解法测Cu的回收率略高，在90.37%～108.15%，较其他两种前处理方法有较高的准确度。湿法消解、干法消解、直接稀释3种前处理方法测得Fe的加标回收率分为在93.64%～118.99%、86.85%～118.31%、95.59%～116.86%，3种前处理方法间没有明显的差别。

3种前处理方法均有较好的精密度（即较低的RSD），在5%以内。对于Cu元素，3种前处理方法RSD平均值大小顺序为湿法消解法（1.48%）＜干法消解法（2.27%）＜直接稀释法（3.64%）；对于Fe元素，3种前处理方法RSD平均值大小顺序为湿法消解法（2.00%）＜直接稀释法（2.40%）＜干法消解法（2.79%）。因此，湿法消解法测定Cu、Fe元素的精密度高于其他两种前处理方法，可能是由于干法消解法和直接稀释法在操作过程中误差较大，而湿法消解法虽然会引入较多的强酸，但赶酸的步骤消除了引入HNO3带来的误差，使得测得结果的精密度相对较高。

2.3.2 不同前处理方法的基本操作条件对比

由表5得知，干法消解法耗时最长，操作马弗炉存在高温危险，不适用大批量的分析，且在干法消解过程中坩埚壁的粘附和硅酸盐形成有可能造成待测元素损失。直接稀释法省时，环境污染少，操作简单，但是由于直接稀释法处理的试液粘度大，会出现堵塞仪器进样针的问题。湿法消解法仪器设备简单，使用强酸消解，操作耗时短，适用于大批量分析，在操作条件上明显优于干法消解法和直接稀释法。

表5 不同前处理方法的基本操作条件对比Table 5 Comparison of basic operating conditions for different digestion methods

表6 葡萄酒样品中Cu、Fe含量测定结果（n=6）Table 6 The measured concentrations of Cu and Fe in wine samples

综合以上试验结果，湿法消解法测得Cu的精密度和加标回收率明显优于其他两种前处理方法，且湿法消解法操作方便快捷，是测定葡萄酒中Cu的较为满意的前处理方式。而关于Fe元素的测定，3种前处理方法测得的结果都较为满意，但是湿法消解法在操作条件上有明显优势，因此三者相比，也应该选用湿法消解法作为测定葡萄酒中Fe的前处理方法。

2.4 样品分析

选用湿法消解-石墨炉原子吸收光谱的方法，对国内外10个品种的红白葡萄酒进行分析，Cu含量在13.40～283.63 μg·L-1，Fe含量在668.83～3380.25 μg·L-1，所有样品的Cu、Fe含量均符合葡萄酒国家标准中的限量标准[6]。RSD在1.16%～5.90%，测量精密度高。

3 结论

干法消解法的特点是操作相对简单，几乎不需要添加其他试剂，样品受污染可能性小，Cu空白值很低。但是低温炭化处理和550 ℃下灰化处理所需时间太长，不宜大批量进行检测，并且高温容易造成部分元素损失，且灰化时瓷坩埚容易形成难溶的复杂硅酸盐，对Cu、Fe元素的测定结果影响较大。

直接稀释法省时，环境污染少，操作简单，也是测定葡萄酒中重金属元素的主要前处理方法之一[17]。但由于葡萄酒基体复杂，存在消解不完全的风险，稀释倍数较小时由于试液黏度大还会影响进样精度，使得测得结果误差较大。

湿法消解法所用仪器设备简单，较干法耗时短，消解过程中不易损失金属元素，消解过程容易控制，适用于大批量分析。本实验选用HNO3+H2O2消解，消解完全，测定结果准确度高，是一种适用性较广且较理想的前处理方法。用石墨炉原子吸收光谱按表2升温程序进行葡萄酒中Cu、Fe元素测定，采用湿法消解前处理方法，测定结果良好，检出限低，相对标准偏差小，加标回收率高，适用于葡萄酒中Cu、Fe元素的测定。