‘赤霞珠’葡萄霜霉病菌卵孢子形成和生活力的研究

张涛，顾沛雯，杜娟，陈思杰，李金，贾宝森

（宁夏大学农学院，宁夏银川 750021）

由藻界卵菌门葡萄生单轴霉（Plasmopara viticola）侵染引起的霜霉病是葡萄生长过程中的毁灭性病害，全世界各葡萄种植区均有发生，是葡萄生长过程中的第一大病害[1]。由于该病属单年流行病害，具有潜育期短、再侵染频繁、病菌繁殖率高的特点，雨热同季的气候易造成病害迅速流行，严重影响葡萄的产量和品质[2-3]。葡萄霜霉菌无性繁殖产生的孢子囊抗逆性差、寿命短，自然条件下难以越冬。有性生殖是通过藏卵器与雄器交配产生厚壁卵孢子。卵孢子能够抵抗不良环境条件，在病残体及病田土壤中越冬，但在自然条件下，葡萄霜霉菌的卵孢子较少见。Lehoezky最早发现卵孢子的存在[4]，随后Burruano等[5]、Kennelly等[6]、Hong等[7]也相继在葡萄叶片组织中观察到卵孢子。在国内，刘延琳等[8]首次在陕西杨凌地区的葡萄霜霉病叶中发现卵孢子，随后金恭玺等[9]采用病部研磨-过筛-离心-镜检的方法证明葡萄霜霉菌卵孢子在病残体上越冬。

目前，国内外学者普遍认为，葡萄霜霉病菌的卵孢子主要在土壤和植物病残体中越冬。卵孢子萌发产生的游动孢子可渗入土壤，感染与土壤接触的茎和叶，造成当年葡萄霜霉病发生与流行[9-11]。在自然条件下，卵孢子一般有4种生活状态：死亡、休眠、萌动和萌发[12]。处于萌发状态的卵孢子有芽管等侵入结构的产生，可以通过显微观察来确定。而处于休眠、萌动和死亡阶段的卵孢子在外观上没有明显区别，无法辨认，在一定程度上阻碍葡萄霜霉病菌病原学和遗传学的研究。虽然在一些地区发现葡萄霜霉菌卵孢子的存在，但未见对酿酒葡萄霜霉菌卵孢子形成及生活力的影响因素进行系统研究的报道，卵孢子在酿酒葡萄霜霉病的生活史和病害循环中的作用尚未达成共识。以酿酒葡萄品种‘赤霞珠’霜霉病叶为材料，在人工模拟条件下研究霜霉菌卵孢子形成和生活力的影响因素，以期为揭示葡萄霜霉病菌卵孢子萌发条件和初侵染源奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 供试植物材料

2020年9月在宁夏志辉源石酒庄葡萄园采集的酿酒葡萄品种‘赤霞珠’（Cabernet Sauvignon）感染霜霉病叶片。

1.1.2 供试试剂

乳酚油（生工生物工程有限公司，上海），噻唑兰（MTT）染色剂（生工生物工程有限公司，上海），H2O2溶液（科密欧化学试剂公司，天津），冰乙酸（广诺科技有限公司，上海），NaOH（双双化工有限公司，烟台）等。

1.1.3 供试仪器

Olympus BX53荧光显微镜（Olympus公司，日本），FSH-2A可调高速均浆机（常州越新仪器制造公司，江苏），Sigma 3K 15离心机（Sigma公司，美国），RQX-250智能人工气候箱（跃进医疗器械有限公司，上海）等。

1.2 影响葡萄霜霉菌卵孢子形成的因素

1.2.1 葡萄霜霉病菌卵孢子观察

参照刘绍芹等方法[13]。将霜霉病叶片的病斑部位，用无菌剪刀剪成大小为0.5 mm2的叶盘，后放置于250 mL烧杯中，加入少许乳酚油试剂，在小型控温电热炉上煮沸5～10 min，至叶片完全透明。以水为浮载剂，在显微镜下观察并拍照。

1.2.2 不同条件对葡萄霜霉病菌卵孢子形成的影响

取镜检无卵孢子形成的葡萄霜霉病叶在室内人工模拟条件下进行试验。采用4因素4水平正交试验设计，因素水平设计如表1。温、湿度处理在人工气候箱中进行，不同成熟度叶片分别从相同发病植株的上、中、下和底部采集，接触物为土壤、沙土、沙子、空白。将不同成熟度的叶片置于装有不同接触物培养皿表面，于不同温湿度的培养箱中培养，7 d后镜检病斑位置，记录单位面积的卵孢子数量。每处理10个叶片，重复3次。

1.3 影响葡萄霜霉菌卵孢子生活力的因素

1.3.1 卵孢子悬浮液制备

采集霜霉病叶，用无菌剪将病斑部位剪下，称取3 g，加入pH7的磷酸缓冲液，使碎叶全部浸润，15 min后滤掉缓冲液，置于冰箱中速冻2 h，采用高速匀浆机5000 r/min下匀浆30 min。将所得匀浆液分别通过200目、300目、600目和800目网筛过滤，用自来水反复清洗各个网筛，后用蒸馏水缓慢冲下600目和800目网筛上的卵孢子于50 mL离心管中，5000 r/min离心5 min，弃掉上清液，后加入少量蒸馏水定容至5 mL，备用。

表1 不同因素处理水平Table 1 Treatment levels of different factors

1.3.2 卵孢子生活力的测定

采用张艳菊等[14]的噻唑兰（MTT）染色法。将制成的卵孢子悬浮液用0.05%的MTT染色剂36 ℃染色48 h，后吸取30 μL在显微镜下观察。每次镜检100个卵孢子，3次重复，观察并记录死亡（黑色）、休眠（红色）和萌动（蓝色）的卵孢子个数。

1.3.3 温度对卵孢子生活力的影响

以室温25 ℃为对照，共设5个温度水平：-20、4、10、20、36 ℃。将含有卵孢子的霜霉病叶片置于不同温度的人工气候箱中，处理时间为1、3、7、9 d后制成卵孢子悬浮液（同1.2.1）。用MTT染色后镜检，并计算死亡率、休眠率和萌动率。每次处理30片叶，重复3次。

1.3.4 湿度对卵孢子生活力的影响

以室内湿度（RH45%）为对照，共设5个湿度水平：30%、60%、80%、90%和100%。将同期采集的霜霉病叶置于不同湿度的人工气候箱中，处理时间分别为1、3、7、9 d，其余步骤同上。

1.3.5 pH对卵孢子生活力的影响

以pH为7的清水处理为对照，将含有卵孢子的霜霉病叶片置于pH为：4.5、5.5、6.5、7.0、8.5和9.5的溶液中，30 min后用清水冲洗叶片，其余步骤同上。

1.3.6 H2O2对卵孢子生活力的影响

以清水为对照，分别用浓度为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%和0.9%的H2O2溶液处理病斑部位病叶。将叶片全部浸润在H2O2溶液中，30 min后取出叶片，用蒸馏水反复冲洗2～3次，其余步骤同上。

1.3.7 叶组织提取液对卵孢子生活力的影响

叶组织提取液的制备：称取10 g健康的葡萄叶片，将表面泥土等杂质冲洗干净，加入一定量的蒸馏水捣碎，充分研磨后过滤，取滤液，高压灭菌30 min。以清水处理卵孢子悬浮液为对照，将叶组织提取液与卵孢子悬浮液体积比1∶1混合，分别处理1、4、7、10 d后，MTT染色，测定卵孢子的生活力状况，重复3次。

1.3.8 土壤浸渍液对卵孢子生活力的影响

土壤浸渍液制备：采集葡萄根际土壤100 g，加100 mL蒸馏水，200 r/min振荡2 h，过滤，收集滤液，备用。以清水处理为对照，将制备的土壤浸渍液与卵孢子悬浮液分别以体积比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4混合，分别处理3、7、9 d后用MTT染色，测定卵孢子的生活力状况，重复3次。

1.4 数据分析

试验数据利用SPSS 21.0软件进行t检验和Duncan氏新复极差法统计分析，并利用OriginPro 8软件作图。

2 结果与分析

2.1 葡萄霜霉病菌卵孢子形成的观察

利用乳酚油对病斑部位进行透明处理，镜检结果表明，能够清楚的观察到病斑部位产生的卵孢子（图1）。

MTT染色结果如图2所示，若卵孢子被染成红色或者紫红色，则其处于休眠状态（图2A）；若为黑色或未着色，则其处于死亡状态（图2B）；若被染成蓝色，则其正处于萌动阶段（图2C）。

2.2 影响葡萄霜霉病菌卵孢子形成的因素

以正交设计进行试验，测定卵孢子的形成数量，结果如表2所示。温度为10 ℃时产生的卵孢子最多为17个/cm2；其次是90%湿度为15个/cm2，-20 ℃没有卵孢子形成。复合因素条件下，以10 ℃、饱和湿度（100%），与壤土接触的中部叶片产生的卵孢子最多为7个/cm2；其次是10 ℃、90%湿度，与沙土接触的上部叶片产生了6个/cm2。由极差大小可知，温度＞湿度＞接触物＞叶片成熟度，表明温度对卵孢子的形成影响程度最大，依次为湿度、接触物和叶片成熟度。

2.3 温度对卵孢子生活力的影响

图3结果显示，与对照处理（CK）相比，不同温度处理对卵孢子生活力有显著影响，36 ℃高温处理萌动率和死亡率最高，休眠率最低。处理3 d时，萌动率最高为10%；处理9 d时，死亡率最高为22%，休眠率最低为76%。4 ℃低温处理3 d和7 d时，休眠率最高，均为94%；死亡率均最低，均为4%；-20 ℃所有处理均无卵孢子萌动，且随着处理时间的延长，死亡率明显升高。在4～10 ℃有利于卵孢子的休眠，平均休眠率超过90%以上；在4～36 ℃范围内，随着温度升高，打破休眠，卵孢子萌动率增加，且死亡率也伴随增加。

图1 葡萄霜霉病菌卵孢子观察Figure 1 Observation on oospores of downy mildew

图2 葡萄霜霉病菌卵孢子MTT染色Figure 2 MTT staining of oospores of downy mildew of grapevine

2.5 湿度对卵孢子生活力的影响

图4结果显示，湿度在45%～100%时，随着湿度的升高，萌动率逐渐升高，休眠率逐渐降低，死亡率也有明显降低。饱和湿度处理3 d时，萌动率最高达12%，且死亡率最低为2%。湿度低于60%时，卵孢子死亡率普遍较高，且不利于萌发，其中以湿度为30%、处理9 d时死亡率达到最高，为23%。在60%～100%湿度范围内，随着湿度增加，卵孢子萌动率升高，而45%以下的湿度有利于卵孢子休眠，且随着湿度减低，死亡率上升。

2.6 pH对卵孢子生活力的影响

图5结果显示，pH在6.5～7范围内有利于卵孢子存活，其中pH为6.5时，卵孢子休眠率最高为92%；pH为7时，萌动率最高为6%，死亡率最低为4%，说明中性环境有利于卵孢子的存活和萌动。pH高于8.5或低于5.5时，卵孢子生活力均显著减低。其中pH 4.5时，卵孢子死亡率最高达到32%；其次是pH为9.5时，达到26%。

2.7 H2O2对卵孢子生活力的影响

图6结果显示，在0.5%～0.9%H2O2浓度时，随着浓度的增加，卵孢子的萌动率和死亡率均升高，休眠率下降。其中H2O2溶液浓度为0.9%时，卵孢子的死亡率和萌动率最高，分别为19%和24%；休眠率最低为57%。而对照处理的休眠率最高，为91%；死亡率和萌动率最低，分别为5%和4%。

2.8 叶组织提取液对卵孢子的生活力影响

图7结果显示，叶组织提取液和对照处理相比没有显著差异，对照处理7 d萌动率最高为5%，休眠率和死亡率之间无显著差异。

2.9 土壤浸渍液对卵孢子生活力的影响

由图8可知，与对照处理相比，土壤浸渍液对卵孢子的萌动有较为显著的影响。当体积比为1∶4处理3 d时，萌动率最高为14%；处理9 d时，死亡率最高为11%。其次，体积比1∶3处理9 d，萌动率为12%；体积比1∶1处理9 d，休眠率最高为94%；处理7 d时，萌动率最低为2%。但各种处理对死亡和休眠的影响并不显著。

表2 温度、湿度、叶片成熟度、接触物对葡萄霜霉菌卵孢子形成的影响Table 2 Effects of temperature, humidity, leaf maturity, and contact materials on oospore formation of downy mildew of grapevine

图3 不同温度对酿酒葡萄卵孢子生活力的影响Figure 3 Effect of different temperatures on the viability of wine grape oospores

图4 不同湿度对卵孢子生活力的影响Figure 4 Effect of different humidity on the viability of oospores

图5 不同pH对卵孢子生活力的影响Figure 5 Effect of different pH on the viability of oospores

图6 不同浓度H2O2对卵孢子生活力的影响Figure 6 Effect of different concentrations of H2O2 on the viability of oospores

图7 叶组织提取液对卵孢子生活力的影响Figure 7 Effect of leaf tissue extract on the viability of oospores

图8 土壤浸渍液对卵孢子生活力的影响Fig 8 Eeffect of soil maceration extract solution on the viability of oospores

3 讨论

目前国内酿酒葡萄霜霉病的研究主要集中在病害发生危害、综合防治、寄主抗性及预测预报等方面[1,15]。有关生物特性研究也主要针对霜霉病菌无性阶段的孢子囊，而对病原菌有性阶段的卵孢子研究较少。对影响卵孢子形成、萌动及存活能力因素的研究尚未见报道，所以卵孢子在生活史和病害循环中的作用尚不完全清楚。通过对‘赤霞珠’葡萄霜霉病菌卵孢子形成影响因素的研究表明，依影响程度排序为温度＞湿度＞接触物＞叶片成熟度。在10 ℃、饱和湿度下，与壤土接触的中部叶片产生的卵孢子最多为7个/cm2。这与张艳菊等[14]的结果相似，说明在人工模拟条件下，采用寄主组织法在适宜的条件下能够获得霜霉病菌的卵孢子。

近年来，MTT染色法已被广泛应用于卵孢子活性检测中。Xavier等[16]利用MTT法首次对栎树猝死病菌（Phytophthora ramorum）卵孢子生活力进行测定。在国内，文景芝等[17]和张艳菊等[14]将其用于大豆疫霉（Phytophthora）和黄瓜霜霉病菌（Pseudoperonospora cubensis）卵孢子生活力检测。研究利用MTT法首次对酿酒葡萄霜霉病菌卵孢子的生活力进行测定，证明MTT染色剂能准确反映卵孢子生活力状况，是一种效果良好的细胞活性指示剂。

卵孢子是葡萄霜霉病菌抵御不良环境的一种生存机制，可以在土壤中存活2年甚至更长时间[7]。自然条件下，葡萄霜霉病菌卵孢子在形成后需要经历一段时间的休眠，在一定的外界刺激后，才会由休眠状态转入萌动状态[17]。对卵孢子生活力研究发现，温度、湿度、pH、过氧化物和土壤浸渍液等对卵孢子的萌动都有一定影响。Toffolatti等[18]研究认为，温度是决定卵孢子萌动和萌发速率的主要限制因子。本研究发现，在4～25 ℃范围内，随着温度的升高，萌动率也随之升高，说明一定的高温刺激可有效打破卵孢子的休眠，温度过低则会抑制卵孢子萌动。湿度在60%以下不利于卵孢子的萌动，同时随着处理时间的增长死亡率也逐渐升高，说明水分是影响卵孢子长期存活的重要因素，且较高的湿度更有利于卵孢子萌动，这与Burruano和Ciofalo等[19]研究结果基本一致。一定浓度的过氧化物可有效打破卵孢子的休眠，促进萌发，但浓度过高也会导致卵孢子死亡。因此可在葡萄霜霉菌卵孢子打破休眠后，应用此法促进卵孢子萌发，为今后卵孢子萌发和侵染试验及其生理和生化特性研究奠定基础。此外，过酸性或过碱性的环境不利于卵孢子萌动和休眠，还会导致卵孢子的迅速死亡。这可能是因为在酸性和碱性环境中，卵孢子的细胞壁和细胞膜的功能被破坏，使有害物质进入细胞内，从而导致卵孢子失活[19]。土壤浸渍液可明显提高卵孢子的萌动率，这可能与葡萄根际土壤中所含的Ca2+有关。Berridge等[20]认为，影响卵孢子萌动的因素除了温度、湿度等外，还与环境中的Ca2+密切相关。Ca2+进入卵孢子细胞内可以激发相应生理过程酶的活性，进而促进卵孢子萌动。但目前有关Ca2+作为外源诱因激发卵孢子萌动的机理还需要深入研究。

4 结论

温度和湿度对卵孢子的形成有明显影响，采用寄主组织法在适宜的条件下能够获得霜霉病菌的卵孢子，同时较高的温湿度、一定浓度的过氧化物和土壤浸渍液对卵孢子的萌动有促进作用。此次研究对卵孢子的生理生化特性有了初步了解，明确了促进卵孢子形成和萌动的一些基础因素，为后续开展卵孢子萌发试验及初侵染来源研究奠定了基础。