酿酒葡萄抗寒性评价及分类

沈甜，牛锐敏，黄小晶，许泽华，陈卫平*

（宁夏农林科学院种质资源研究所，宁夏银川 750002）

贺兰山东麓葡萄酒产区已在国内外享有盛名，目前酿酒葡萄面积为3.09万 hm2，占全国的1/4，因其优越的地理资源和产地优势，成为我国酿酒葡萄第4个原产地域产品保护区[1]。由于该产区主栽品种多为欧亚种群，其抗寒能力普遍较差，越冬冻害发生频率高，影响范围大；加之春季气温回升快，晚霜冻结束时间晚，出土较早的园区经常受到晚霜危害；且冬季埋土和春季出土用工量大，种植成本较高[2-3]。因此，开展酿酒葡萄抗寒性研究有助于揭示葡萄越冬冻害形成机理，对促进产业可持续发展具有重要意义。

葡萄抗寒性的鉴定方法及抗寒生理的研究已有诸多报道，张倩等[4-5]对5个葡萄种群18个品种根系的抗寒适应能力和抗寒适应性观察，通过Logistic方程确定其拐点温度，为将LT50作为葡萄抗寒种质的筛选指标提供理论和实践依据。杨豫等[6]以各品种的根系表皮作为测定部位，利用热电偶温度传感器测定了8个酿酒葡萄根系的过冷却点、结冰点等，揭示供试品种根系的抗寒能力。付晓[7]以45份鲜食葡萄品种一年生休眠枝条为试材，采用差热分析法得出抗寒性强的品种随着温度的降低放热程度减小，抗寒性弱的品种放热程度增大。国内外的葡萄抗寒性育种均是利用山葡萄、河岸葡萄、蘡薁葡萄等抗寒性强的品种进行杂交，从山欧、山欧美杂种二代中选育出的‘左红一’在吉林极端最低气温-39.8～-30.6 ℃的情况下，连续7年露地越冬无冻害发生[8]，中国科学院植物研究所利用我国特有的野生葡萄资源山葡萄与欧亚栽培品种杂交获得的‘北玫’和‘北红’葡萄根系可耐-11 ℃，枝条可耐-30 ℃的低温，在宁夏贺兰山东麓产区不埋土防寒情况下，‘北红’和‘北玫’的成活率均在90%以上，但其酿制的单品种干红葡萄酒酸度高，适口性差[9-10]。

细胞质膜是组织细胞对外界低温环境反应最为敏感的部位，同样也是植株最初受到冻害的部位。当温度降低到一定程度时，细胞膜的透性发生改变，细胞膜内大量的可溶性物质渗出，细胞膜内外的离子失衡，导致细胞生理生化和功能发生改变[7]。研究表明，相对电导率、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛、游离脯氨酸等指标虽不能直接判断品种间的抗寒性强弱，但都与抗寒性有密切的关系[11-12]。利用高低温交变试验箱对酿酒葡萄一年生枝条进行低温冷冻处理，通过测定生理生化指标，应用聚类分析，对供试品种的抗寒能力进行鉴定和评价，为今后的抗寒性育种资源利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验地位于银川市西夏区芦花台宁夏农科院枸杞研究所葡萄基地，东经106°8'39''～106°8'44''，北纬38°28'43''～38°38'58''。试验园地四周空旷，地形平坦，地下水位较浅。土壤属于灌淤潮土，表层沙壤，土壤肥力较高，pH8.1～8.3。

1.2 试验材料

供试品种为宁夏农林科学院种质资源研究所葡萄资源圃的15个3年生酿酒葡萄（见表1）。各品种采用直立龙干整形，南北行向，株行距0.5 m×3.0 m，秋季以短梢修剪为主。2018年10月冬季修剪时采集枝条，每个品种选择充分成熟、粗度均匀一致的一年生健壮枝条20个，沙藏贮存备用。2019年3月取出枝条，用自来水和蒸馏水冲洗干净。每3～4节剪成一段，石蜡封口。每个品种7份，每份约10段用塑料袋包好，置于冰箱贮藏备用。

表1 供试品种情况Table 1 Introduction about the tested varieties

1.3 试验处理

用高低温交变试验箱（型号：BC1300）对供试枝条进行低温冷冻处理，设置-15、-18、-21、-24、-27、-30 ℃ 6个低温处理，以2 ℃贮藏枝条样本为对照。升降温度速率均为4 ℃/h，降温至目的温度保持24 h后以相同的幅度匀速升温至2 ℃，取出后在2 ℃冷藏保存进行相关指标的测定。

1.4 试验相关指标测定及计算

1.4.1 相对电导率测定和半致死温度计算

将冷冻后的枝条避开芽眼剪成3～4 mm小段，混合均匀，称取2 g放入25 mL具塞刻度试管中，加20 mL去离子水摇匀，每处理3次重复。在室温下浸提24 h后，用DDSJ-308F型电导仪测初电导率。封口，于沸水中煮30 min，冷却至室温，放置2 h后测定终电导率[13]。

相对电导率（%）＝初电导率/终电导率×100

LT50计算参照Logistic回归方程：

Y＝K/(1＋ae－bt)

式中：Y为电导率，t为处理温度，K为Y的最大值。通过直线回归的方法求出方程参数a、b值，拐点温度即枝条的半致死温度（LT50）。

1.4.2 游离脯氨酸含量

将冷冻后的枝条避开芽眼剪成3～4 mm小段，混合均匀，称取0.5 g剪碎于具塞试管中，加5 mL 3%磺基水杨酸，沸水浴10 min，吸取2 mL提取液加2 mL冰乙酸，再加3 mL酸性茚三酮后沸水浴40 min，冷却至室温后加5 mL甲苯充分混匀，避光静置萃取至少4 h。吸取上层红色液体在520 nm下测定吸光值，从标准曲线上查得脯氨酸浓度，计算游离脯氨酸含量[14-15]。

1.4.3 丙二醛含量

将冷冻后的枝条避开芽眼剪成3～4 mm小段，混合均匀，称取0.5 g样品置于盛有2 mL 10%三氯乙酸溶液的研钵中冰浴研磨至匀浆，用8 mL 10%三氯乙酸溶液分次冲洗转入离心管中低温离心（4000 r/min，10 min），吸取2 mL上清液加2 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液，充分混匀后沸水浴15 min，静置冷却至室温分别在450 nm、532 nm、600 nm下测定吸光值，计算丙二醛含量[14-15]。

1.5 数据处理与分析

用Excel 2007进行数据处理和制图，SPSS 23.0进行单因素方差分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 低温对供试品种相对电导率的影响

由表2可知，各品种枝条经不同低温处理后，相对电导率随处理温度的降低呈上升趋势。在2 ℃下‘西拉’枝条的相对电导率显著高于其他品种，‘马瑟兰’显著低于其他品种；在-18 ℃时，‘西拉’和‘德引84-5’的相对电导率均显著高于其他品种，并且急剧上升，其他品种的相对电导率缓慢增加，在47.97%～58.24%；在-21℃时除‘埃兰菲舍尔’外，其他品种枝条的相对电导率均达到60%以上；在-30～-27 ℃低温处理下，各供试品种枝条的相对电导率增加已经趋于平缓，基本全部达到90%以上；在-27 ℃时，只有‘紫大夫’的相对电导率低于90%，显著低于其他品种；-30 ℃时，各品种的相对电导率在92.05%～95.25%。对于供试品种的半致死温度，-20 ℃以下的有‘霞多丽’‘小芒森’‘艾伯灵’‘赤霞珠’‘埃兰菲舍尔’‘法国蓝’‘黑曼道克’‘小味儿多’和‘马瑟兰’9个品种，其中以‘埃兰菲舍尔’最低，‘西拉’最高。

2.2 低温对供试品种游离脯氨酸含量的影响

各供试品种枝条中的游离脯氨酸在低温胁迫下的测定结果如图1所示，随着胁迫温度的降低，供试枝条中游离脯氨酸呈先上升后下降的趋势。在-15 ℃，‘霞多丽’‘紫大夫’‘威代尔’‘小芒森’‘艾伯灵’‘法国蓝’‘琼瑶浆’和‘黑曼道克’枝条中游离脯氨酸高于对照，其他品种均表现出降低，其中‘埃兰菲舍尔’和‘马瑟兰’在-15 ℃时枝条游离脯氨酸仅有0.02 μg/g。其后，随着胁迫温度的降低，各品种枝条中游离脯氨酸变化明显，‘美乐’‘德引84-5’‘艾伯灵’‘赤霞珠’‘法国蓝’‘琼瑶浆’‘黑曼道克’‘小味儿多’枝条中游离脯氨酸在-21 ℃出现最高值，‘法国蓝’最高，比对照增加2.71倍；在-24 ℃的低温胁迫下，枝条中游离脯氨酸最高的是‘霞多丽’和‘西拉’；在-27 ℃的低温胁迫下，‘紫大夫’‘威代尔’‘小芒森’‘马瑟兰’枝条中的游离脯氨酸较高，其中‘小芒森’最高，‘马瑟兰’最低；‘埃兰菲舍尔’在胁迫低温-30 ℃时其游离脯氨酸达到最大值，比对照增加15.14倍。总体来看，白色葡萄品种在低温胁迫后枝条中游离脯氨酸普遍低于红色品种。

2.3 低温对供试品种丙二醛的影响

由图2可知，随着胁迫温度的降低，供试品种枝条中丙二醛总体呈先下降后升高的趋势。在2 ℃条件下各品种枝条中丙二醛均为低温胁迫的最高值，除‘小味儿多’为9.80 μmol/g，其他品种枝条中丙二醛为10.35～15.88 μmol/g，其中‘法国蓝’最高。在不同低温胁迫下，在-21 ℃时出现丙二醛最低值的品种有‘紫大夫’‘西拉’‘德引84-5’‘马瑟兰’，丙二醛最高的是‘美乐’；-24 ℃时丙二醛降到最低值的品种有‘艾伯灵’；-27 ℃时‘霞多丽’‘美乐’‘小芒森’‘赤霞珠’和‘马瑟兰’的丙二醛为最低，最高为‘美乐’；-30 ℃时出现最低值是‘威代尔’‘埃兰菲舍尔’‘琼浆浆’‘黑曼道克’和‘小味儿多’，其中最低的是‘小味儿多’，最高的是‘埃兰菲舍尔’；在-30 ℃时丙二醛含量出现增加的有‘霞多丽’‘西拉’‘美乐’等8个品种，其中增加值最高的是‘赤霞珠’，其次是‘霞多丽’。白色葡萄品种在低温胁迫后枝条中游离丙二醛普遍低于红色品种。

表2 低温胁迫过程中相对电导率及半致死温度（LT50）变化Table 2 Changes of low temperature on relative conductivity and their semi-lethal temperature (LT50)

图1 不同低温处理游离脯氨酸含量变化Figure1 Changes of free proline contents in shoots after low temperature treatments

2.4 基于供试品种半致死温度的聚类分析

采用系统聚类组间联接法，根据半致死温度对15个葡萄品种进行聚类。由聚类分析谱系图（图3）可知，在平方欧氏距离为2.5时，15个酿酒葡萄品种分为5类，第Ⅰ类有‘威代尔’‘琼瑶浆’‘霞多丽’‘马瑟兰’‘小芒森’‘赤霞珠’，这一类酿酒葡萄枝条的半致死温度在-20.56～-19.89 ℃，第Ⅱ类有‘紫大夫’‘美乐’，这一类酿酒葡萄枝条的半致死温度在-19.39～-18.99 ℃，第Ⅲ类有‘黑曼道克’‘小味儿多’‘艾伯灵’‘法国蓝’，这一类酿酒葡萄枝条的半致死温度在-21.49～-21.17 ℃；第Ⅳ类有‘西拉’‘德引84-5’，其半致死温度最高，分别是-17.99～-17.33 ℃，抗寒能力最弱；第Ⅴ类有‘埃兰菲舍尔’，其枝条的半致死温度最低，抗寒能力最强，基于半致死温度的抗寒能力由强到弱依次是：Ⅴ类＞Ⅲ类＞Ⅰ类＞Ⅱ类＞Ⅳ类。在平方欧氏距离为5.0时，15个酿酒葡萄品种被分为3类，第Ⅱ类是‘西拉’和‘德引84-5’，第Ⅲ类是‘埃兰菲舍尔’，其余的酿酒葡萄品种全部被划分为Ⅰ类，基于半致死温度的抗寒能力由强到弱依次是：Ⅲ类＞Ⅰ类＞Ⅱ类。

图2 不同低温处理丙二醛含量变化Figure 2 Changes of malondialdehyde contents in shoots after low temperature treatments

图3 基于半致死温度的聚类树形图Figure 3 Clustering tree based on semi-lethal temperature

图4 基于全部测定值的聚类树形图Figure 4 Clustering tree of 15 wine grape varieties based on all measured value

2.5 基于供试品种指标测定值的聚类分析

采用系统聚类组间联接法，依据对照和6个低温胁迫下测定的相对电导率、游离脯氨酸和丙二醛对15个酿酒葡萄进行聚类（图4），在平方欧氏距离为2.5时，15个酿酒葡萄品种分为10类，第Ⅰ类有‘小芒森’‘琼瑶浆’‘紫大夫’‘威代尔’‘马瑟兰’，第Ⅱ类有‘赤霞珠’，第Ⅲ类有‘埃兰菲舍尔’，第Ⅳ类有‘美乐’，第Ⅴ类是‘德引84-5’，第Ⅵ类是‘霞多丽’和‘黑曼道克’，第Ⅶ类是‘艾伯灵’，第Ⅷ类是‘小味儿多’，第Ⅸ类是‘法国蓝’，第Ⅹ类是‘西拉’。在平方欧氏距离为5.0时，15个酿酒葡萄品种分为7类，第Ⅰ类有‘小芒森’‘琼瑶浆’‘紫大夫’‘威代尔’‘马瑟兰’‘赤霞珠’，第Ⅱ类有‘埃兰菲舍尔’，第Ⅲ类有‘美乐’‘德引84-5’，第Ⅳ类有‘霞多丽’‘黑曼道克’和‘艾伯灵’，第Ⅴ类是‘小味儿多’，第Ⅵ类是‘法国蓝’，第Ⅶ类是‘西拉’。抗寒能力最弱的‘西拉’和最强的‘埃兰菲舍尔’均各自为一类。

3 讨论与结论

植物在逆境条件下能够通过调节体内一系列生理生化过程来提高对逆境的抵御能力，并且在一定温度下，通过诱导植株细胞的代谢活动向着适应低温、增加抗寒性的方向发展。细胞电解质的外渗程度可用相对电导率来表示，以反映植物细胞膜系统的低温伤害程度[16-17]；半致死温度是判断植物逆境伤害的指标之一[18-19]，尤其在果树抗寒性上有广泛应用[20-21]。通过高低温交变试验箱对资源圃的15个酿酒葡萄一年生枝条进行不同低温处理，各品种在不同低温胁迫下相对电导率差异明显，抗寒性强的品种，其电导率和相对电导率的上升速率低于抗寒性弱的品种，这与前人研究结果一致，‘西拉’在低温胁迫下相对电导率显著高于其他品种，其次是‘德引84-5’，‘埃兰菲舍尔’的相对电导率最低。

脯氨酸介导植物体内很多细胞和亚细胞的反应，脯氨酸的积累是由于植物体内脯氨酸生物合成激活和脯氨酸降解的抑制共同导致的[22]，并且在逆境解除后被迅速分解利用[23]。而植物体内游离脯氨酸能促进蛋白质的水合作用，蛋白质胶体亲水面积增大，能使植物处于低温时免受伤害。丙二醛是膜脂过氧化作用的最终产物，其累积量是反映植物遭受逆境伤害程度的重要指标[24]。试验结果显示，游离脯氨酸和丙二醛呈显著的负相关，与曹建东[25]研究结果一致。各品种游离脯氨酸及丙二醛在不同胁迫温度下差异明显，‘法国蓝’的游离脯氨酸在低温胁迫下明显高于其他品种，而‘埃兰菲舍尔’的游离脯氨酸在低温胁迫下明显低于其他品种，其游离脯氨酸在-30 ℃时达到最大值；‘马瑟兰’的丙二醛在不同低温处理下明显低于其他品种，‘法国蓝’则明显高于其他品种。葡萄中脯氨酸在-15 ℃处理后明显增加，而在-21 ℃后大部分品种的脯氨酸明显下降。李桂荣等[26]指出，随着胁迫温度的逐渐降低，脯氨酸越早出现最大值的其抗寒能力就越弱，但‘艾伯灵’在-18 ℃脯氨酸达到最大值，‘霞多丽’的脯氨酸在-24 ℃时达到最大值，而依据半致死温度得出‘艾伯灵’的抗寒能力强于‘霞多丽’，因此判定植物抗寒能力强弱应综合各项指标。

研究结果显示，葡萄枝条在低温处理初期丙二醛呈下降趋势，随着胁迫深入，丙二醛逐渐升高，说明在进行抗寒锻炼的初期，生理上有一个适应过程，随着温度的持续降低，各品种中丙二醛含量呈升高趋势，特别是在-15 ℃处理后，增加趋势更加明显，这也验证了前人的研究结果[5]。在对照温度2 ℃下，各品种枝条中丙二醛含量较高，可能原因是此温度正是其抗寒锻炼的临界值。

依据不同低温胁迫下相对电导率、游离脯氨酸及丙二醛测定值将15个酿酒葡萄聚为7类（平方欧式距离＝5），第Ⅰ类有‘小芒森’‘琼瑶浆’‘紫大夫’‘威代尔’‘马瑟兰’‘赤霞珠’，第Ⅲ类有‘美乐’和‘德引84-5’，第Ⅳ类有‘霞多丽’‘黑曼道克’和‘艾伯灵’，其他品种各自为一类。而基于半致死温度将供试品种聚为3类（平方欧式距离＝5），第Ⅱ类是‘西拉’‘德引84-5’，第Ⅲ类是‘埃兰菲舍尔’，其余的酿酒葡萄品种全部被划分为Ⅰ类。基于半致死温度的抗寒能力由强到弱依次是：Ⅲ类＞Ⅰ类＞Ⅱ类。

国内在葡萄形态结构、膜脂成分及蛋白质、抗寒生理生化、种质类型等方面的研究已取得显著进展[27-30]，但在具体评定葡萄抗寒性时，还应多方面综合评价，同时结合田间观察，才能使结果更加准确、科学。抗寒育种工作是一项长期的事业，本文通过聚类分析将不同酿酒葡萄品种分为不同类别，期望为今后抗寒育种研究提供一定的理论支持。