基于SSR标记的MCID法鉴定72个酿酒葡萄品种

傅伟红，魏新科，葛孟清，刘崇怀*，房经贵*

（1. 南京农业大学园艺学院/江苏省果树品种改良与种苗繁育工程中心，江苏南京 210095；2. 中国农业科学院郑州果树所，河南郑州 450009）

葡萄栽培历史悠久，品种繁多。目前，已发现的葡萄属种质资源有70多个种，已登记的品种有1.6万个，而中国种质资源圃中保存的大约有2000多种[1-2]。葡萄在自然条件下极易产生芽变，同时在长期人为活动如引种、选种、交换、栽培中也易发生混乱，同名异物或同物异名现象非常严重。而且随着栽培范围的扩展，育成种质数目呈快速增长趋势，使得葡萄的选育和推广面临许多困难[3]。

本文所选的72个品种包括国内自育品种以及许多国外引进的优良品种，大部分是品质优良的酿酒品种，还有一些是酿酒鲜食兼用品种，在我国葡萄与葡萄酒产业的发展中具有重要地位。传统的形态学鉴定由于易受环境条件的影响，已逐渐不能满足需求[4]，因此绘制直观可靠的品种鉴定图，对于苗木早期鉴定、品种权利保护、生产中品种的区分和命名以及葡萄种质资源的评价等具有重要的实际意义[5-6]。

DNA分子标记是以个体间核苷酸差异为基础，建立在分子水平上的遗传标记技术，在植物育种和遗传资源管理中有着广泛的应用[7-8]。DNA分子标记具有高度专一性和特异性、信息量大，还有操作方便、遗传稳定、不受环境因素影响等优点，且与形态、生理和生化指标等方法比较，其在鉴定作物新品种及检测种子纯度方面具有很大优势[9-12]。但是，由于缺乏可以将DNA指纹转化为品种区分信息的理想措施，无法使其在品种鉴定中的优势发挥出来，以往利用二元表与进化树等呈现不同植物材料或品种的鉴定结果，仅仅表达DNA标记能够区分这些品种的技术优势，但难以提供用于区分这些品种可依据的实用性的鉴定结果。

MCID法（Manual cultivar identification diagram）是一种新的基于DNA分子标记的人工绘制品种鉴别示意图的方法。该方法对同一引物PCR扩增后的多态性谱带进行分类，把电泳后具有相同谱带的分为同一组，有特异性谱带的则被区分出来，在图上标记相应的引物和谱带，从而绘制准确、直观、实用的品种鉴定图[13]。MCID方法的应用不仅可以使RAPD、SSR等DNA标记在鉴定果树品种中的利用成为实用性的简便工具，更使DNA标记技术在果树乃至生物样品鉴定中的优势得到了充分实现[14]。该方法真正意义上将DNA指纹技术鉴定品种获得的结果转化为简便、利用价值很高的能具体指导品种鉴定实践的实用信息，最终获得的品种鉴定图（CID）能够成为植物品种快速鉴定的依据。该方法已经在多种植物品种的分类、种质资源的遗传基础研究、遗传图谱的构建等方面较为广泛地应用。孙钧等[13]利用5对SSR多态性引物成功鉴定了14份白沙枇杷资源，并构建了相应品种鉴定图谱。黄丹娟等[15]基于SSR荧光标记的MCID法鉴定了13种茶树品种。许园园等[16]基于RAPD扩增，利用MCID方法对20个萝卜品种进行鉴定，同时进行遗传多样性分析。

本研究利用国际通用的6对SSR引物，结合MCID法对待鉴别的72个酿酒葡萄品种的DNA进行PCR扩增，对SSR结果进行分子鉴定和初步的遗传多样性分析，绘制品种鉴定图，以期将72个品种在分子水平准确地区分，同时为酿酒葡萄品种鉴定与资源利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的72种酿酒葡萄品种的试验材料均来源于中国农业科学院郑州果树研究所。选取的材料为国内酿酒葡萄品种以及常见国外酿酒品种的新梢幼叶，装入冰盒之中带回实验室，之后先用蒸馏水洗干净叶片，去除叶脉并用吸水纸吸干，用液氮速冻然后置于-40 ℃冰箱暂时保存。葡萄品种详见表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

取叶片50 mg研磨成粉末，转移到1.5 mL离心管中。采用传统CTAB法提取样品的基因组DNA，使用核酸蛋白测定仪（Nano-100）测定DNA样品浓度，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA样品质量。并用ddH2O稀释至50 ng/μL于-20 ℃保存备用，初始浓度的DNA同样在-20 ℃冰箱中保存。

1.2.2 引物筛选与构建

试验参照国际葡萄品种目录数据库（Vitis Internationl Variety Catalogue, VIVC, http://www.vivc.de/）公布的9对葡萄国际通用引物进行筛选分析，引物序列由通用生物公司合成。选择3个遗传差异较大的葡萄DNA对9对引物进行筛选，经过PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳，从中选取扩增条带清晰稳定、多态性好的引物用于所有DNA 样品的扩增。引物序列及退火温度见表2。

表1 供试葡萄品种介绍Table 1 Grape cultivars used in this study

表2 SSR引物及退火温度Table 2 The SSR primers and annealing temperature used in this study

1.2.3 PCR扩增与检测

PCR反应液体系为25 μL，其中含DNA模板1 μL，正反向引物各1 μL，2×Hieff PCR Master Mix（YEASEN公司生产）12.5 μL，H2O 9.5 μL。PCR扩增程序：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32个循环，最后72 ℃延伸10 min，保存4 ℃保存。

1.2.4 PCR产物电泳检测

SSR-PCR产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）中电泳分离，用双蒸水清洗电泳后的凝胶，清洗完毕用0.2% AgNO3溶液震荡染色2 min，之后置于显色液中进行显色反应，显色液配方为1.5%NaOH:37%甲醛=300:1。直至条带清晰，在灯光下对条带进行观察并做好记录、统计，用相机拍照后保存图像用于后续分析制作CID。

1.2.5 数据统计与分析

将SSR分子标记统计基因型转化为0-1数据，先在电泳图上选取一个长度，将在同一分子量上，有特征条带的记为1，没有条带的记为0，数据缺失记为9，以此得到数据库。利用NTSYS-pc 2.10e软件中Similarity选项下的Qualitative data模块得到遗传相似系数矩阵，由遗传相似系数矩阵在Clustering选项中的SHAN模块，进行UPGMA聚类分析，通过Tree plot程序得到聚类图。

1.2.6 人工绘制植物品种鉴别图法

在PCR反应产物中选取能扩增出清晰条带的引物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，以此鉴定72个酿酒葡萄品种。首先选择其中某一对引物的PCR扩增电泳图谱，对在相同电泳迁移率处（相同分子量片段）的特异性条带进行多态性统计，有扩增谱带的品种归类为一组，没有谱带的归类为另一组。通过这种方法，扩增后能产生唯一特异性条带的品种就可以首先被区分鉴别出来，其余具有相同大小带型的品种则被分成几个不同的亚组。再通过其他更多引物逐级区别每个亚组中的品种，直至所有待鉴别的品种都被单独区分。最后，通过对比谱带后获得的分组信息，人工绘制直观的品种鉴别图谱，在树形鉴别图上将每一次筛选用的引物以及多态性谱带大小逐一进行标记[9,16-17]。人工绘制的植物品种鉴别图是在PCR扩增后，对获得的谱带形态进行分析，以引物作为节点，以特征谱带的有无作为分类的依据，充分、直观地反映出6对通用引物鉴别区分72个酿酒葡萄品种的图谱关系。

图1 引物组合VvMD27扩增72个酿酒葡萄品种Figure 1 Primer VvMD27 amplification of 72 wine grape varieties

2 结果与分析

2.1 PCR引物筛选结果

初步选择9对扩增条带清晰且多态性好的引物（VvS2、VvMD5、VvMD7、VvMD25、VvMD27、VvMD28、VvMD32、VvMD62、VvMD79），通过统计，从中筛选出6对引物进行CID的制作（VvMD27、VvMD28、VvMD32、VvS2、VvS7、VvS5）。图1是引物组合VvMD27对72个品种的扩增电泳图，分析可见，这些引物均能在供试样品中扩增出清晰、稳定、重复性和多态性较高的条带。说明对应编号的引物都可为SSR引物筛选提供参考。

2.2 遗传多样性分析

以从9对引物组合中筛选的扩增条带清晰且有明显多态性片段的8对引物的SSR扩增产物为基础，通过NTSYS-pc 2.10e 软件得到72个酿酒葡萄品种的聚类图（图2）。

由图2分析可知，分子标记可以有效的将72个酿酒葡萄品种区分开。在遗传相似系数为0.52左右时，可以分为4个类群，其中，类群Ⅰ包含20个品种，类群Ⅱ包含13个品种，类群Ⅲ包含14个品种，类群Ⅳ包含25个品种，表明大多数材料之间存在着显著的遗传差异。以类群Ⅱ中的15份材料为例，‘小黑葡萄’（4）、‘西尔瓦’（11）、‘黑格兰’（32）、‘艾布林’（14）、‘白比诺’（15）、‘佳利酿’（36）、‘黑佳酿’（7）、‘阿利戈特’（12）、‘贵人香’（30）、‘黑佳美’（33）、‘红玫瑰’（34）共11个欧亚种被聚类在这个类群，但是欧美杂种‘巴柯’（5）和欧山杂种‘北玫’（21）也被聚在了类群Ⅱ中。其中有5个品种来源于法国，3个品种来源于中国，2个品种来源于德国，2个品种来源于西班牙，1个品种来源于保加利亚。以上结果说明这13份材料的遗传多样性与其所属种有一定关系，而与地理来源关系不大。

由于聚类分析产生的树状图和系统发育树无法显示特定的引物和多态性标记等可参考的信息，限制了分子标记在品种鉴定中的实际应用。葡萄品种鉴定是一个重要研究领域，随着葡萄品种的不断增多，想要对这些酿酒葡萄进行正确的鉴定与分类的需求也越来越迫切。因此，建立一个快速、简便、切实可用的分析措施将会使DNA分子标记在品种鉴定中发挥重要作用[18]。

2.3 酿酒葡萄品种鉴定

利用SSR建立72个酿酒葡萄的MCID，结合筛选的6对引物的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，运用MCID法将72个品种逐一单独区分鉴别出来。为了观图简洁方便，将每个品种的编号用对应的数字表示。

首先根据引物VvMD27扩增的电泳图上大小为250 bp、310 bp和370 bp的3条特征性条带的有无将72个品种分成7组，将有特征性谱带的用(+)表示，没有特征性谱带的用(-)表示。第1组是250 bp(+)、310 bp(-)和370 bp(-)，包括9个品种；第2组为250 bp(+)、310 bp(+)和370 bp(-)，包括15个品种；第3组是250 bp(+)、310 bp(-)和370 bp(+)，包括5个品种；第4组只有310 bp谱带，缺失250 bp和370 bp谱带，包括7个品种；第5组是250 bp(-)、310 bp(+)和370 bp(+)，包括8个品种；第6组只有370 bp谱带的分组，包括10个品种；第7组为3条特征性谱带250 bp、310 bp和370 bp均不含有的共18个品种。

利用引物VvMD27将72个品种分为7类之后，继续利用更多的引物分别鉴定7个组的所有品种。以第2组的15个品种为例，先利用引物VvMD28进行扩增，首先鉴定出同时具有250 bp、330 bp两条多态性谱带的‘小黑葡萄’（4）。其余14个品种被分成3组，有250 bp谱带，没有330 bp谱带的为2-1组，包括6个品种；有330 bp谱带，没有250 bp谱带的为2-2组，包括3个品种；两条谱带均没有的为2-3组，包括5个品种。再利用引物VvMD32进行扩增，只有240 bp条带，缺失350 bp条带的‘甲州’（37）被鉴定出来；同时具有240 bp和350 bp条带的是‘北醇’（19）、‘卡拉’（38）、‘长相思’（44）；只有350 bp条带，缺失240 bp条带的为‘郁金香’（53）和‘小白’（61）。之后继续利用引物VvS2扩增，有200 bp条带，缺失260 bp条带的‘长相思’（44）被单独鉴定出来；有260 bp条带，缺失200 bp条带的为‘北醇’（19）和‘卡拉’（38）两个品种。最后通过引物VvS7进行扩增，具有250 bp条带的为‘卡拉’（38），缺失250 bp条带的为‘北醇’（19）。2-2组和2-3组的品种同样可以利用VvMD32和VvS2分别鉴定。

其他6组按照此方法依次鉴定，利用6对引物就可以区分所有品种。最后，根据所有引物及相应谱带信息绘制72个品种的鉴定图，即酿酒葡萄品种CID（图3）。

MCID是一种可以简单快速地鉴别任何品种的方法，具体步骤是先根据扩增条带的有无以及多态性筛选待鉴定品种区分所需引物，利用筛选出的引物进行PCR扩增，最后对PCR扩增的多态性条带进行分析观察，分步将待鉴定品种区分出来。例如：区分‘香宝馨’（2）和‘晚红蜜’（45）2个酿酒葡萄品种，在MCID中分别找到品种对应数字2和45。我们发现，用引物组合VvS7即可区分2个品种，利用该引物对，‘香宝馨’在250 bp处有特异性条带，而‘晚红蜜’则没有，简单快速达到区分品种的目的。同样，如果区分‘西尔瓦’（11），‘阿利戈特’（12）和‘灰比诺Fr70/125A’（35）3个品种时，首先在MCID上得到3个品种最先分支的引物为VvS2，多态性条带为260 bp和200 bp，通过该引物可将3个品种分为‘阿利戈特’（12）、‘西尔瓦’（11）与‘灰比诺Fr70/125A’（35）两组，之后再利用VvS7引物和250 bp条带将‘西尔瓦’与‘灰比诺Fr70/125A’区分，这样3个品种就能完全区分。

图2 72个酿酒葡萄品种基于SSR分析的聚类图Figure 2 UPGMA dendrogram of the 72 wine grape varieties on the basis of SSR markers

3 讨论与结论

葡萄是世界上重要的果树之一。在葡萄生产中，对获取的优良新品种进行保护时，该品种应被鉴定，与已有品种准确区分[19]。随着葡萄与葡萄酒产业的扩大，对酿酒葡萄资源的收集评价、特异种质的挖掘变得尤为重要，这就需要找到一种兼具准确性和实用性的植物品种鉴定方法。DNA分子标记技术与形态标记、细胞学标记和生化标记相比，优越性明显，具体表现在多态性高、数量极多、不影响目标性状的表达等方面[20]。一些DNA标记技术例如SSR、ISSR、RAPD、AFLP等因其各自的优势特点，已经被广泛地应用于各类植物遗传多样性分析与种质鉴定工作中。

图3 6对引物鉴别区分72个酿酒葡萄品种的MCID示意图Figure 3 MCID of 72 wine grape varieties by using six pairs of SSR primers

以上的DNA分子标记技术多在构建指纹图谱后利用聚类分析进行品种之间遗传差异的探究，无法作为品种鉴定的根本依据。而MCID法很好地解决了品种鉴定的问题，一般只需要几对引物就能鉴定较多品种，且操作简单、直观有效、稳定性高、实用性强[21]。目前MCID 法已经被用于多个树种的鉴定，如利用基于SSR标记的MCID法鉴定白沙枇杷、茶树、柿等[13,15-16]，基于RAPD标记的MCID法鉴定葡萄、青花菜等[17,22]，这些研究都表明了MCID法在鉴定品种上的可行性。

本研究利用NTSYS-2.10e软件的聚类分析功能，通过8对引物扩增的多态性条带，将72个酿酒葡萄品种在遗传相似系数为0.52左右时分为4个类群，简单区分了个别遗传关系较远的品种，但这种方法不能将遗传关系相近的品种单独鉴定。本研究同时进行的基于SSR标记的MCID方法解决了这个问题，只用了6对引物构建了72个酿酒葡萄品种的MCID图谱，快速、准确地进行鉴别。图谱直观显示了整个鉴别过程，在葡萄品种一定的情况下，可以简单明了找出各品种鉴定所需要的引物及其对应的特异性条带长度。随着葡萄新品种的培育以及种质资源调查的深入，需要鉴别的品种不断增加，可以利用本研究所使用的6对引物进行多次PCR扩增，根据聚丙烯酰胺凝胶电泳带型将其标注在MCID图谱的相应位置上，即可获得包含更多新品种的MCID图。若现用引物无法鉴别新品种，则选用新引物再进行区分。

基于SSR标记的MCID法较其他分子标记鉴定方法有了较大突破，即利用尽可能少的引物扩增，根据不同引物所获得的特异性谱带依次鉴定出所有品种，操作简便、目的性强，更适用于大量品种的快速鉴定。较好地解决了品种鉴定中各品种间亲缘关系不清、品种繁杂无法区分的问题。对实现酿酒葡萄种质资源管理、苗木早期纯度鉴定、促进酿酒葡萄品种的保护以及指导实际生产均具有重要意义。