208个葡萄品种染色体倍性的流式细胞分析

裴丹，葛孟清，董天宇，魏新科，刘崇怀，房经贵*

（1. 南京农业大学园艺学院，江苏南京 210095；2. 中国农业科学院郑州果树所/农业部果树育种重点实验室，河南郑州 450009）

葡萄（2X=38）是二倍体植物。其在进化与利用过程中，形成了很多不同倍性的葡萄品种，且葡萄无性繁殖的特点能将多倍体的优良性状稳定地保存下去。由于多倍体葡萄具有生长旺盛、枝粗、叶厚、果大、产量高、同化物质含量高、种子数量少且部分发育不良，果实成熟期提前等优点，在生产上广泛推广。

染色体鉴定方法分为直接鉴定法与间接鉴定法。直接鉴定法又称染色体计数法，可直接鉴定染色体倍性。这种方法鉴定结果准确，但耗时长，对操作要求高，不适宜大量样品材料的倍性鉴定。间接鉴定法不能直接进行染色体计数，是通过观察植株形态、细胞形态，进行杂交试验或微观分子技术来间接进行染色体倍性鉴定。其中，植物形态学鉴定法较为简便，但受个人主观因素影响较大；细胞形态学鉴定法比较可靠，但操作过程复杂；梢端组织鉴定法能够准确鉴定嵌合体倍性；杂交鉴定倍性所需时间较长，且需事先了解植物遗传规律[1]。流式细胞术（Flow cytometry，FCM）是应用流式细胞仪进行分析、分选的技术，对处于液流中的各种荧光标记微粒进行多参数快速准确地定性、定量测定。在植物学研究中，FCM主要用于检测植物细胞核DNA含量[2]及其倍性水平[3]，其中分裂间期G1期的DNA含量可间接反映该细胞的倍性水平，因此测定植物细胞核DNA含量的同时可以获取倍性水平相关数据，绘制成流式图谱，峰图纵坐标为粒子数，横坐标为相对荧光强度。

葡萄染色体倍性的信息对于葡萄品种资源的科学利用具有参考价值[4]。本文对目前中国自主育成的部分葡萄品种进行倍性鉴定，以期为葡萄倍性鉴定及多倍体育种提供理论依据。同时，鉴别葡萄倍性水平还对研究其系统进化、澄清物种起源模式具有非常重要的意义[5]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

随机取自中国农科院郑州果树所国家葡萄资源圃以及其他院所保存的208个葡萄品种。选取植株幼嫩叶片，经冰袋运输后置于4 ℃下保存，在最短时间内完成测定。

1.2 实验方法

1.2.1 缓冲液的配制

解离细胞核所用的解离液按照表1[6]中的配方配制，通过试验进行筛选。

染色缓冲液为解离液中加入20 mg/L碘化丙啶（PI）和20 mg/L的RNA酶。

表1 解离液种类及组分Table 1 Categories and componets of dissociation solutions

1.2.2 细胞核溶液的制备

（1）称取约1 g幼嫩的葡萄叶片，蒸馏水洗净表面尘土，滤纸吸干后放入预冷的培养皿内，加入预冷的解离液（1 mL），用锋利的刀片一次性快速切碎，整个过程材料需浸没在解离液中，以便更好地游离细胞核。

（2）吸取培养皿内的解离液，用300目的滤膜过滤至1.5 mL离心管中，然后置于4 ℃冰箱中，孵育5 min。

（3）1000 r/min，离心5 min，温度为4 ℃。

（4）弃上清后，再加入200 μL预冷的染色缓冲液，4 ℃避光染色5 min。

1.2.3 流式细胞术测定

样品的细胞核DNA含量在南京农业大学生命科学学院实验教学中心大型仪器共享平台进行检测。所用机型为美国BD（Becton, Dickinson and Company）公司生产的Accuri C6 Ⅱ流式细胞仪。光源由波长为488 nm氩离子激发，染色的DNA分子促发荧光，测定其荧光强度，与测定装置相连的计算机分析软件即可对荧光强度进行分析。本次实验所有测试样品的细胞核DNA含量是以对照为标准的相对值，每次检测至少收集10 000个颗粒。

2 结果与分析

2.1 葡萄染色体流式细胞检测技术体系的建立

2.1.1 解离液的筛选

流式细胞仪的结果图中通常会出现样本峰和碎片峰，理想的样本峰应为左右对称且峰型集中，而单坡峰则是碎片峰。在控制处理一致的条件下，使用上述3种解离液对葡萄叶片解离后进行流式细胞仪分析发现，经otto's（图1A）和LB01（图1B）处理的葡萄叶片都无法产生完整的样本峰，叶片细胞核DNA含量少，碎片峰面积大。WPB（图1C）对于葡萄叶片的解离效果最好，其样本峰峰型集中，碎片峰面积小，测定结果准确。故选用WPB作为解离液。

2.1.2 FCM检测葡萄倍性方法的建立

使用WPB解离液解离葡萄叶片后，经流式细胞仪分析样品的细胞核情况，仅检测到了一个峰（G1期），G1期细胞核DNA的含量可以反应细胞的倍性水平，且随着倍性水平的增高，细胞核DNA含量增加，如二倍体‘玫瑰香’的峰值出现在横坐标50处，三倍体‘夏黑’的峰值出现在横坐标75处，四倍体‘巨峰’的峰值出现在横坐标100处（图2）。因此，可根据荧光强度的相对位置判断葡萄品种的倍性情况。

在同一次试验中出现如图3所示，A峰为‘京紫晶’（2N），B峰为 ‘郑果28号’（2N），二者DNA含量的相对荧光强度有细微的差异。这可能是由于非整倍体造成的，类似的研究也曾在香蕉上有过报道[7]。

图1 三种解离液筛选结果Figure 1 Screening results of three dissociation solutions

图2 三种倍性的葡萄DNA含量分布Figure 2 Nuclei DNA content of 3 different types grape ploidy

图3 两个二倍体葡萄品种的DNA含量Figure 3 DNA content of two diploid grape varieties

2.2 葡萄染色体的倍性分析情况

对208份葡萄品种材料检测后，获得了其倍性情况（表2，见文后）。

其中共有二倍体品种138个，三倍体品种11个，四倍体品种59个。其中自育品种二倍体106个，三倍体9个，四倍体47个；国外引进的品种二倍体32个，三倍体2个，四倍体12个（表3）。

2.3 葡萄染色体的倍性与果粒大小

四倍体中特大粒果的比例明显高于二倍体和三倍体葡萄果实（表4），在同一亲本不同倍性条件下，果粒大小也有显著差别，如‘四倍体玫瑰香’的平均粒质量为7 g，‘玫瑰香’（2N）的平均粒质量为5 g；‘红太阳’（芽变红地球，4N）的平均粒质量为18 g，‘红地球’（2N）的平均粒质量为12 g[8]。证明在多倍体化的过程中，葡萄的果粒也显著增大。

3 讨论与结论

对于染色体数目较多的材料，直接鉴定法难度高，且耗时长。而利用流式细胞仪能够迅速准确地判断葡萄倍性水平[9]。细胞核内DNA分子数目越多，DNA分子链越长，PI嵌入的量就越多，经激光照射，促发荧光强度越强。因此，在同一条件下，可利用DNA所发荧光强度的强弱判断细胞核DNA含量的多少。在判断大量样品的倍性时，可根据已知倍性葡萄品种的峰值位置来判断位置样品的倍性[10]。但是利用流式细胞仪测定基因组DNA含量还存在一些问题，如样品制备、染色、标样等均会对测定结果产生影响，所以不易鉴别出非整倍体，如有需要可以通过细胞学进行准确鉴定。

表3 国内外葡萄品种倍性情况Table 3 Ploidy of domestic and abroad grape varieties

表4 不同倍性间果粒大小情况Table 4 Berry size among different ploidy

在本试验统计的208个葡萄品种中，二倍体葡萄品种最多占66.3%；现代栽培的葡萄四倍体品种大多是从自然产生的突变体（芽变）衍化和秋水仙素诱导而来，故四倍体品种占比较低，为28.4%；由于利用二倍体和四倍体进行有性杂交的亲和力差，杂种胚早期败育或胚乳解体，很难获得杂交后代。即便利用胚挽救技术也很难保证成活率，所以三倍体品种最少，仅有5.3%[11]。通过分析品种倍性与果粒大小认为，在多倍体化的过程中，葡萄的果粒也显著增大。因此，多倍体育种是获得大粒葡萄新品种的重要途径之一。

表2 208个葡萄品种倍性Table 2 Ploidy of 208 grape cultivars

续表2 Continued table 2

续表2 Continued table 2

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