河北产区酿酒葡萄酵母菌的分析及鉴定

赵晓宁，王焕香，罗飞，商华，李磊，朱光华，尹甜，傅晓方，邢姗姗，边可欣，高大威*

（1. 燕山大学环境与化学工程学院，河北秦皇岛 066000；2. 中国长城葡萄酒有限公司，河北怀来 075499）

葡萄酒是以葡萄为原料经微生物发酵的产物，葡萄酒酿造已经有五、六千年的历史，早在人们认识微生物之前，已经不自觉的利用微生物进行葡萄酒的酿造[1]。随着显微镜的发明及应用，人们对微生物的认识越来越深刻。1968年Amerine等[2]发现成熟的葡萄浆果表面存在许多不同属的酵母菌，这些酵母菌都有一定的发酵能力。随后的葡萄酒研究领域中，酵母菌成为研究热点之一。酵母品种种类及性能直接决定所酿果酒品质的优劣[3-4]，因此揭示酿酒葡萄中酵母菌的组成对提高葡萄酒的质量及进一步弄清酵母菌对葡萄酒品质的影响有重要意义。

葡萄酒的酿造过程是利用酵母菌将葡萄内的大部分糖转化为酒精和CO2，同时生成甘油、高级醇、酯类、醛类等代谢产物，直接影响葡萄酒的色泽、香气及口感，也决定了葡萄酒的质量和风格。葡萄品种和质量一旦确定，要获得能够充分反映葡萄品种特色和优良品质的葡萄酒所选酵母至关重要，可以说酵母菌是葡萄酒品质的灵魂[5-6]。由于受环境因素的影响，某些酵母菌属、种在形态学及生理生化特性方面的差异极不显著，采用传统方法对它们进行分类相当困难，而通过分子手段对酵母菌进行鉴定的准确性很高[7-9]。本研究对河北昌黎和沙城两地所产的酿酒葡萄中的酵母菌株进行分离，根据其在WL培养基上的菌落颜色及形态进行初步分类，并进行生理生化鉴定，最后运用RAPD聚类分析对这些菌株进行分类以探讨河北地区葡萄酒相关酵母菌的种类多样性，为该地酿酒酵母的应用提供基础资料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原料

本研究于2010年9～10月从河北昌黎和沙城两地的主要酿酒葡萄产区采集不同品种成熟的葡萄果粒，葡萄品种包括‘赤霞珠’‘玫瑰香’‘龙眼’‘霞多丽’‘蛇龙珠’作为菌株分离源，从葡萄表面分离纯化共得到73株酵母菌，随机抽取出其中的30株进行后续研究。

1.1.2 主要试剂和仪器

dNTP mix（10 mmol/L，北京艾德莱生物科技有限公司）；随机引物（20 μmol/L，北京恒博和泰生物科技有限公司）；MgCl2（25 mmol/L）、Taq酶（5 U/μL）、10×Reaction Buffer购于上海Promega公司；温度梯度PCR仪购于德国Whatman Biometra公司，稳压稳流电泳仪购于北京六一仪器厂；凝胶成像系统购于美国Gene Company Limited公司。

1.1.3 培养基

（1）YPD 固体培养基。葡萄糖20 g，酵母膏 10 g，蛋白胨 20 g，琼脂 20 g，溶于1 L蒸馏水中，115 ℃灭菌30 min。

（2）酵母菌保藏培养基。YPD液体培养基，分离出的菌种保藏在YPD液体培养中，于-80 ℃冻存。

（3）WL营养琼脂培养基。酵母浸粉4.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖50.0 g，琼脂20.0 g，磷酸二氢钾0.55 g，氯化钾0.425 g，氯化钙0.125 g，硫酸镁0.125 g，氯化铁0.0025 g，硫酸锰0.0025 g，溴甲酚绿0.022 g，溶于1 L蒸馏水中，115 ℃灭菌30 min。pH6.5。

1.2 葡萄果粒表皮酵母菌多样性分析方法

1.2.1 生理生化鉴定

本研究参照《酵母菌的特征与分类鉴定手册》，部分鉴定方法略有改进。

（1）发酵糖类试验。鉴定所用发酵糖类包括葡萄糖、D-果糖、麦芽糖、乳糖和蔗糖。将上述糖分别加入到含有杜氏发酵管的生理生化培养基中，使之含量达到50 mmol/L，经过滤除菌。将活化后的酵母菌分别接入到上述培养基中，培养一周后观察，以杜氏小管中有气泡计为阳性，无气泡为阴性，同时记录发酵液表面菌醭生成情况。

（2）硝酸盐还原试验。将生长旺盛的酵母菌菌株接种在硝酸盐培养基中，25 ℃下培养7 d，将甲、乙两混合液按1∶1混合（甲液：对氨基苯磺酸0.8 g＋5 mol/L醋酸l00 mL；乙液：α-奈胺0.5 g＋5 mol/L醋酸l00 mL），每5 mL培养液加入混合液0.1 mL后，观察结果呈现红色为阳性，若无红色出现，应进一步检查。向上述试管中加少许锌粉，若出现红色，表示硝酸盐仍存在，为阴性反应；若不产生红色，表示硝酸盐已被还原为氨和氮，仍为阳性反应。

（3）生成类淀粉化合物试验。将培养基倒平板，接种已活化好的酵母，于28 ℃培养1～2周后，在平板长菌处周围滴加卢格氏碘液，观察酵母菌落周围是否呈现蓝色。

（4）同化肌醇试验。采用固体培养法，将酵母菌接种到含有肌醇的碳源同化基础培养基上，置于28 ℃温度下培养7 d，每天观察一次生长情况。

（5）尿素分解试验。将供试酵母菌接种于尿素酶试验基础培养基上，28 ℃培养5 d，其间每天观察一次，出现深红色者为阳性反应。

表1 WL培养基上酵母菌形态特征Table 1 Yeasts morphology characteristics in WL medium

（6）放线菌酮素抗性试验。在12 mm口径试管中每管加入3.6 mL蒸馏水，115 ℃灭菌30 min，加入0.4 mL放线菌素酮母液。接种、培养、结果记录和判定方法皆与肌醇同化试验相同。

1.2.2 形态学鉴定

称取葡萄果皮1.0 g，加入50 mL灭菌的液体YPD培养基（加30 mg/L亚硫酸钠）中，25 ℃摇床培养48 h。将富集液用生理盐水进行不同梯度稀释后涂布平板，25 ℃培养48 h，转接并经多次划线纯化，获得纯化菌株。取分离得到的酵母菌株划线接种于WL培养基[10]，28 ℃培养5 d，观察菌落的颜色，形态，表面是否光滑，边缘是否整齐等特征。同时，在显微镜下观察酵母的细胞形态以此对分离到的酵母菌株进行初步的形态分类。

1.2.3 酵母菌RAPD聚类分析

RAPD反应选用随机引物5'-AGGGAACGAG-3'进行扩增，反应体系的总体积为25 μL，包括1 μL基因组DNA，2.5 μL 10×PCR缓冲液，2 μL 25 mmol/L MgCl2，0.5 μL 10 mmol/L dNTPs，0.5 μL 5 U Taq DNA聚合酶，2 μL 20 μmol/L随机引物和16.5 μL ddH2O。每个反应为35个循环，每个循环包括94 ℃ 30 s，36 ℃ 30 s，72 ℃1 min。循环前在94 ℃预变性3 min，循环结束后在72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物在1%琼脂糖中电泳，EB染色后经凝胶成像系统检测并拍照。利用RAPD-PCR-RFLP program进行酵母菌的聚类分析。将所得电泳图谱输入DSP软件中，按步操作，得出菌株间的遗传相似系数。

表2 30株酵母菌糖发酵试验结果Table 2 Results of 30 yeast strains sugar fermentation test

2 结果与分析

2.1 利用WL培养基对酵母菌初步形态分类

从沙城的玫瑰香葡萄表面分离所得酵母编号为B1～B3，霞多丽葡萄表面分离所得酵母编号为C1～C3，龙眼葡萄表面所得酵母编号为D1～D4，蛇龙珠葡萄表面所得酵母编号为E1～E4；从昌黎十里铺的赤霞珠葡萄表面分离所得酵母编号为赤1、赤2、赤4、赤5、赤8、赤11、赤12、赤14、赤16，玫瑰香葡萄表面所得酵母编号为玫1、玫2、玫3，龙眼葡萄表面所得酵母编号为龙1～龙4。用WL营养琼脂培养基， 根据菌落的颜色和形态将其聚类，共分为5种形态类型[11]，如表1。

由此可见，菌落颜色有灰绿色带蓝色、深绿色、奶油色带绿色、奶油色等，菌落质地粘稠，菌落有的平伏，有的中间隆起，表面有的光滑反光，有的光滑黯淡，菌落边缘形态各异。

2.2 生理生化鉴定

2.2.1 发酵糖类试验结果

不同的含糖培养基对所分离的菌株进行糖发酵试验结果见表2。碳源是微生物生长必需的含碳营养物，约占酵母菌体干重的50%，因此碳源是仅次于水分的菌株生长需求量的一大类营养物质。碳源是组成其结构的物质，同时对异氧微生物来说，碳源为其生命活动提供所需要的能量[12]。碳源的种类不同，对酵母菌的生长也有不同的影响，酵母菌对各种碳源的利用因种类不同而存在差异，本试验中所用碳源分别为葡萄糖、D-果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖。由表2可知，编号为B1、E1、龙1、龙2、龙4、玫3的酵母菌株可发酵3种以上糖类；酵母菌株C1、D1、赤8、赤12、赤16不能发酵这5种糖[13]。

2.2.2 其他生理生化试验结果

由表3可知，所有供试菌株均不能产生类淀粉化合物，也不能分解尿素；只有酵母菌D2、E2、玫1、玫3可以还原硝酸盐；编号为B1、D4、龙4、玫1、玫3的酵母菌可以同化肌醇；赤4、赤11、龙2、龙3和龙4具有抗放线菌酮的特性。

表3 30株酵母菌菌株生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of 30 yeast strains

2.3 PCR扩增产物的电泳检测

采用SDS裂解法从供试酵母菌株中提取基因组DNA，经核酸蛋白测定仪检测纯度和含量，OD260/OD280的值均接近1.8，所以其纯度均能满足PCR扩增反应要求。将引物扩增后用于1%琼脂糖凝胶电泳。对图1的电泳结果分析，30株酵母菌进行RAPD扩增及电泳后，有20株酵母菌扩增出了相应DNA条带，扩增条带数目在1～7条，其分子量在250～3000 bp。由图谱可以看出，大多数酵母菌的扩增条带数均在3条以上，说明此引物对菌株的多态性较好，重复2次结果一致，从而进一步说明此引物可以对大多数酵母菌进行鉴别与分类。

2.4 酵母菌株的聚类分析

以遗传相似性为基础，应用RAPD-PCR-RFLP program软件，和UPGMA（Unweighted Pair Group Method Using Average Linkage）算法将20株酵母菌进行聚类分析并建立遗传进化树状图，如图2。从聚类结果可以看出，20株酵母菌被分成2组，第一组由19株酵母菌组成，遗传相似系数从53.43%至100.00%，其中E3和E4、玫3和龙1、赤1和D3、赤8和赤16、B1和B2、D2和D4的遗传相似系数分别达到100.00%；第二组只有玫1。与第一组比较，遗传相似系数为10.79%。遗传相似系数达到100.00%的菌株具有极高的同源性，可以认定为同一种菌。因此，经过聚类后，成功地去除6株菌，剩余14株菌。再利用菌株的形态学特征、生理生化特点及其遗传相似性进行种属的分析。据生理生化特征，查阅《酵母菌的特征与分类鉴定手册》，进一步确定各菌株所在属是否符合此分类，并最终将菌株鉴定到种（表4）。

图1 酵母菌株的PCR电泳图Figure 1 PCR electrophoresis of yeast strains

图2 20株酵母菌的RAPD聚类分析Figure 2 RAPD cluster analysis of 20 yeast strains

表4 不同产地不同葡萄品种所附酵母菌种属Table 4 Different grape varieties attached yeast genera in different regions

3 讨论与结论

从河北沙城、昌黎酿酒葡萄产地采集不同品种样品，从葡萄表面共分离得到73株酵母菌，本次试验随机抽取了其中的30株进行相关研究。结果表明，所分离的菌株属于7个不同的属：酵母属（Saccharomyces）、有孢汉逊酵母属（Hanseniaspora）、毕赤氏酵母属（Pichia）、酒香酵母属（Brettanomyces）、克勒克酵母属（Kloeckera）、假丝酵母属（Candida）、隐球酵母属（Cryptococcus）。各个菌株的形态学和生化特性都符合相应的种属，共分布于14个种。这一结果表明，酿酒葡萄果粒表皮上含有丰富的酵母菌资源，并可解释因葡萄酒多年酿造，一些菌株在此环境中含量较高，并在葡萄表明形成优势生长的结果。与昌黎相比，沙城地区的昼夜温差较大，总体气温偏低，所以初步推测两地葡萄表面所附酵母菌种类差异可能与此有关。从鉴定结果可见，昌黎地区鉴定得到的种属数要多于沙城地区，这可能由于昌黎的地理和气候条件较为适宜酵母菌的生存，适合各类酵母菌的生长。可见，两地相同葡萄表面酵母菌种存在很大差异。本研究对于葡萄果皮上所存在酿酒酵母种类、数量以及不同品种葡萄所附着的酿酒酵母的种类均具有重要的参考价值，为筛选适合该产区葡萄酒生产的优良酵母菌种奠定了基础。

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